Allergic bronchopulmonary aspergillosis in patients with asthma: dynamics of immunological parameters during antimycotic therapy

Full Text

Микроскопические грибы (микромицеты) чрезвычайно широко распространены в окружающей среде. Aspergillus spp. - один из основных плесневых грибов, который может быть источником аллергенов как в открытом воздухе современных городов, так и внутри жилых и производственных помещений. Споры Aspergillus fumigatus очень малы, имеют диаметр 3-5 мкм и могут поэтому глубоко проникать в респираторный тракт и колонизировать дыхательные пути [1]. Попадая в бронхиальное дерево, конидии грибов активируют иммунный ответ и вызывают воспалительное повреждение тканей, в результате чего могут формироваться бронхоэктазы и фиброз. Клинические проявления гиперчувствительности к Aspergillus spp. у больных с атопией могут варьировать от обострений бронхиальной астмы (БА) до развития тяжелой БА с микогенной сенсибилизацией и аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АБЛА) [2-5]. Кроме того, при вдыхании большого количества грибковых спор возможно поражение не только легких, но и придаточных пазух носа с формированием аллергического аспергиллезного синусита [6]. Наиболее часто АБЛА осложняет течение БА и муковисцидоза. Для больных этих групп характерны нарушения защитных механизмов слизистых оболочек дыхательных путей, в том числе дефекты мукоцилиарного клиренса Российский Аллергологический ^^урнал № 6-2016 37 Оригинальные статьи и функции эпителиальных клеток [7]. Все это облегчает колонизацию дыхательных путей грибковыми спорами. Для АБЛА характерны разнообразные клинические и рентгенологические проявления, которые обычно сопровождаются неконтролируемой БА, рецидивирующими легочными инфильтратами, бронхоэктазами и прогрессирующей дыхательной недостаточностью [8, 9]. АБЛА был впервые описан Hinson и соавт. в 1952 г. С тех пор выявление случаев АБЛА возрастает с каждым годом во всех странах. Кроме того, результаты многочисленных исследований свидетельствуют о высокой частоте микогенной сенсибилизации у больных БА. По данным Agarwal и соавт., которые провели мета-анализ 21 исследования, у больных БА частота сенсибилизации к Aspergillus spp. составила 28%, а развитие АБЛА - 12,9% [10]. У больных муковисцидозом аналогичный мета-анализ 64 исследований показал, что частота сенсибилизации к Aspergillus spp. в этой группе больных составляет 39,1%, а развитие АБЛА - 8,9% [11]. Однако крупные популяционные исследования, оценивающие истинную распространенность АБЛА в России, отсутствуют. Известно, что в патогенезе АБЛА принимают участие различные клетки иммунной системы, такие как дендритные клетки, тучные клетки, базофилы, врожденные лимфоидные клетки 2-го типа (ILC2) и Т-хелперы 2-го типа (Th2). Их объединяет способность к продукции интерлейкинов (IL-4, IL-5 и IL-13), ответственных за выраженность аллергического воспалительного ответа, а именно эозинофи-лии, гиперпродукции слизи и переключение синтеза иммуноглобулинов на IgE-класс [1, 6]. Поэтому препаратами первой линии для лечения АБЛА являются оральные глюкокортикостероиды. Также в терапии пациентов используют антифунгальные препараты [9, 10]. Однако количество исследований эффективности применения азолов в лечении АБЛА ограничено, а влияние антимикотической терапии на иммунологические показатели пациентов требует дальнейшего изучения. Цель работы состояла в определении частоты развития АБЛА у больных БА и изучении динамики иммунологических показателей больных АБЛА на фоне применения антимикотической терапии. Материалы и методы. В проспективное исследование включили 176 больных БА, медиана возраста - 32 года (от 23 лет до 71 года). Обследование больных включало сбор анамнестических данных (первые симптомы заболевания и время их появления, динамика развития, возможный контакт с плесневыми грибами дома или на работе, наличие аллергических реакций, наследственность по атопии, предшествующая терапия и ее эффективность и т. д.), а также оценку результатов общеклинических, лабораторных, инструментальных методов диагностики. Для выявления АБЛА всем больным БА проводили специфическое аллергологическое обследование, которое включало кожное тестирование с 6 грибковыми аллергенами: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Pénicillium, Rhizopus, Candida («Allergopharma», Германия, разрешение этического комитета СЗГМУ им. И.И. Мечникова от 24.06.2014 г.). Методом иммуноферментного анализа определяли уровень общего IgE (ООО «Полигност», Россия) и аллерген-специфических IgE (ас^Е) к грибковым (панель биотинилированных аллергенов «Алкор Био», Россия) в сыворотке крови. Микологическое исследование включало микроскопию и культуральное исследование образцов респираторных биосубстратов: мокрота, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). При подозрении на АБЛА выполняли компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки. Уровень контроля симптомов и степень тяжести БА определяли в соответствии с критериями «Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы» (GINA, 2014). Критерием микогенной сенсибилизации считали положительный результат кожных prick-тестов и/или выявление в сыворотке крови уровня ас^Е к грибковому аллергену, соответствующего классу 1 и выше [8]. Диагноз АБЛА устанавливали на основании известных критериев [12]. Контрольную группу составили 7 условно здоровых людей в возрасте от 33 до 49 лет, медиана - 43 года. Для оценки продукции цитокинов ex vivo использовали цельную кровь, взятую в вакутейнеры с гепарином (20 МЕд/мл). Кровь разводили 1:5 питательной средой RPMI 1640 с добавлением L-глутамина («Биолот», Россия), 200 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия). Спонтанную продукцию цитокинов определяли в супернатанте культуры клеток без добавления индукторов. Для оценки митогенин-дуцированной продукции IFN-y инкубацию клеток крови проводили в течение 24 ч с фитогемагглютинином (ФГА) в концентрации 50 мг/мл («Sigma», США). Продукцию IFN-y и IL-10, активированную аллергеном A. fumigatus («Алкор Био», Россия) в концентрации 10 мкг/мл, определяли на 6-е сутки. После окончания инкубации надосадочную жидкость аликвоти-ровали и замораживали при -20 °С до проведения анализа. Полученные супернатанты использовали для определения спонтанной и индуцированной продукции цитокинов методом иммунофермент-ного анализа с использованием коммерческих тест-систем («Вектор-Бест», Россия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Полученные в процессе исследования данные обрабатывали с использованием программной системы Statistica 10. Данные представляли в виде 38 Российский Аллергологический ^^урнал № 6-201 6 Аллергический бронхолегочный аспергиллез у больных бронхиальной астмой медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, Lq и Hq). Для оценки различий между независимыми выборками применяли непараметрический критерий Манна-Уитни, между зависимыми выборками использовали критерий Вилкоксона. Достоверными различиями сравниваемых параметров считали значения р<0,05. Результаты и обсуждение В микологической клинике СЗГМУ им. И.И. Мечникова в Санкт-Петербурге обследованы 176 больных БА. Микогенную сенсибилизацию выявили у 69 больных БА, что составило 39,2% от общего числа обследованных. Результаты аллергологического обследования сопоставимы с другими исследованиями. Самая высокая частота микогенной сенсибилизации отмечена к Aspergillus spp. (27%). Частота сенсибилизации к другим микромицетам составила: Penicillium spp. - 23%, Alternaria spp. - 18%, Mucor spp. - 12%, Cladosporium spp. - 12%, Rhizo-pus spp. - 2%. Далее у больных БА с микогенной сенсибилизацией проанализировали уровень общего IgE, который является важным показателем для диагностики и мониторирования течения АБЛА. Были выделены больные БА с микогенной сенсибилизацией, которые имели высокий уровень общего IgE (>1000 МЕд/ мл) и характерную клиническую картину заболевания. А именно, несмотря на проведение стандартной противоастматической терапии, пациенты предъявляли жалобы на приступообразный кашель с отделением желто-коричневой мокроты, одышку, субфебрильную температуру. Именно эти особенности течения заболевания могут свидетельствовать о наличии АБЛА, который должен быть подтвержден результатами дальнейшего обследования. Провели посев респираторных биосубстратов и выполнили КТ органов грудной клетки. На основании результатов углубленного микологического и рентгенологического обследования выявили 7 больных АБЛА в возрасте от 29 до 78 лет (медиана - 38 лет). Таким образом, частота развития АБЛА у больных БА в нашем исследовании составила 4%. Исходно у всех больных prick-тест с A. fumigatus был положительный, в сыворотке крови выявлен повышенный уровень ас^Е к A. fumigatus (Ме 6,47 (4,14^17,96) МЕд/мл). Признано, что во время обострения АБЛА уровень общего IgE может достигать чрезвычайно высоких значений, отражая продолжительную аллергенную стимуляцию гуморального иммунного ответа [6, 9, 10, 12]. У больных, включенных в исследование, установлено значительное повышение уровня общего IgE (Ме 963 (956М691) МЕд/мл). Рост грибов рода Aspergillus при культуральном исследовании мокроты является вспомогательным, но не диагностическим маркером АБЛА. Это связано с тем, что Aspergillus spp. выявляют в биосубстратах больных и при других легочных заболеваниях в связи с широким распространением плесневых микроми-цетов в окружающей среде [10]. У обследованных пациентов при культуральном исследовании мокроты и/или бронхоальвеолярной жидкости (БАЛ) у 5 (71%) больных выявляли рост A. fumigatus, у 2 (29%) - A. niger. Рентгенологические признаки являются важным диагностическим критерием АБЛА. На КТ органов грудной клетки при АБЛА обычно выявляют «летучие инфильтраты», бронхоэктазы, слизистые пробки, мозаичные изменения рисунка, центролобулярные узелки, помутнения в виде «дерева в почках» и плевролегочный фиброз [9, 12]. В анализируемых случаях, по данным КТ органов грудной клетки, у 4 (67%) больных обнаружена очаговая и сегментарная инфильтрация легких (рис. 1), у 3 (50%) - бронхоэктазы (рис. 2). Известно, что реакция иммунной системы на конидии и гифы плесневых микромицетов начинается с распознавания патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs) клетками врожденного иммунитета. Основными PAMPs клеточной стенки A. fumigatus являются ß-глюкан, хитин, галактоманнан и галактозаминогалактан [13, 14]. Микромицеты распознаются клетками врожденной иммунной системы посредством паттерн-распозна-ющих рецепторов (PRRs), таких как Toll-подобные рецепторы (TLRs), лектиновые рецепторы С-типа (CLRs) и NOD-рецепторы (Nucleotide Oligomerization Domain - домен олигомеризации нуклеотидов) [15]. Связывание Aspergillus spp. с PRRs активирует внутриклеточные сигнальные пути дендритных клеток, что приводит к выработке хемокинов и цитокинов, ответственных за формирование различных типов адаптивного иммунного ответа. Преимущественная Рис. 1. Аллергический бронхолегочный аспергиллез. Инфиль-тративные изменения в правом и левом легком Российский Аллергологический ^^урнал № 6-2016 39 Оригинальные статьи Рис. 2. Аллергический бронхолегочный аспергиллез. Бронхо-эктазы правого и левого легкого активация Th1 определяет развитие клеточного иммунного ответа, эффекторными клетками которого являются макрофаги и нейтрофилы, способные фагоцитировать и разрушать клетки A. fumigatus. Напротив, в основе патогенеза АБЛА лежит аллергический воспалительный ответ, обусловленный сдвигом иммунного ответа по ^2-типу. Кроме того, получены данные, что конидии Aspergillus spp. обладают уникальными свойствами в усилении активности ILC2 и Th2 к выработке IL-4, IL-5 и IL-13. Именно эти цитокины отвечают за выраженность аллергического воспалительного ответа, а именно эозинофилию, гиперпродукцию слизи и переключение синтеза иммуноглобулинов на IgE, а также снижение продукции IFN-y ТЫ-клетками. Таким образом, считают, что сенсибилизация к Aspergillus spp. у пациентов с БА существенно усугубляет дисбаланс Th2/Th1 и поддерживает хроническое аллергическое воспаление при АБЛА [16, 17]. Следовательно, необходимо было оценить особенности цитокинового профиля у больных АБЛА при стимуляции клеток крови аллергеном A. fumigatus. При этом надо учитывать, что спонтанная продукция медиаторов свидетельствует о состоянии клеток иммунной системы ex vivo, в то время как индуцированная выработка цитокинов позволяет оценить функциональные резервные возможности клеток. Результаты определения иммунологических параметров представлены в табл. 1. Не установлено достоверных различий в способности клеток к спонтанной продукции IFN-y и IL-10 у больных АБЛА по сравнению с условно здоровыми лицами. Стимуляция клеток крови аллергеном A. fumigatus течение 6 сут выявила различия в цитокиновом профиле. В контрольной группе грибковый аллерген стимулировал лимфоциты к продукции IFN-y, но не к выработке IL-10. Медиана индекса соотношения индуцированной продукции IFN-y/IL-10 (ИС IFN-y/IL-10) равнялась 1,64. Полученные данные совпадают с результатами других авторов, которые установили, что у здоровых людей чаще выявляются Aspergillus-специфичные клоны Т-лимфоцитов, вырабатывающие IFN-y и редко секретирующие IL-4, IL-17 и IL-10 [18]. В нашем исследовании у больных АБЛА антиген-специфическая стимуляция выявила достоверно более высокую продукцию клетками крови IL-10 по сравнению со значениями в группе контроля и снижение в 3,72 раза ИС IFN-y/IL-10. На основании полученных данных можно предположить, что у больных АБЛА усилена активность антиген-индуцированных регуляторных Т-лимфо-цитов, что свидетельствует о включении механизмов ограничения воспалительного процесса. Однако высокие урони ас^Е к A. fumigatus свидетельствуют о том, что противовоспалительный цитокин IL-10 преимущественно подавляет продукцию IFN-y, и это способствует преобладанию ^2-типа иммунного ответа у больных АБЛА. Таблица 1. Показатели спонтанной и антиген-активированной продукции цитокинов у больных АБЛА Показатели IFN-y (пг/мл) IL-10 (пг/мл) ИС IFN-y/IL-10 Группа Спонтанная Индуцированная A. fumigatus Спонтанная Индуцированная A. fumigatus Больные АБЛА (n=7) 7,2 (3,5-22,0) 27 (16,4-59,0) **0,043 21,6 (15,7-32) 72,2 (44,8-108,2) *0,015; **0,012 0,44 (0,29-0,74) *0,032 Контрольная группа (n=7) 20 (18-24) 55 (40-55) 20 (14-45) 17 (8-45) 1,64 (1,18-5,00) Примечание. Представлены медианные значения с интерквартильным размахом 25-75% - Me (Lq-Hq), стимуляция 6 сут; * достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой; ** достоверность различий между спонтанной и индуцированной продукцией цитокинов. 40 Российский Аллергологический ^^урнал № 6-201 6 Аллергический бронхолегочный аспергиллез у больных бронхиальной астмой В настоящее время целями терапии АБЛА являются достижение контроля над астмой, профилактика и лечение обострений, предупреждение развития бронхоэктазов и хронического аспергиллеза легких. В качестве противовоспалительной терапии используют системные глюкокортикостероиды, а для уменьшения грибковой нагрузки в дыхательных путях - антимикотические препараты [9, 10]. Назначение специфических антимикотических препаратов при АБЛА позволяет ослабить иммунный ответ в связи с уменьшением антигенной стимуляции и таким образом избежать или снизить потребность в стероидной терапии [5, 6]. В ходе исследования больным АБЛА проведено лечение итраконазолом в дозе 400 мг в сутки. У всех больных после 24 нед терапии отмечен выраженный клинический эффект: уменьшение одышки и кашля, улучшение показателей функции внешнего дыхания, положительная динамика на КТ органов грудной клетки. Все больные переносили препарат хорошо, нежелательных явлений не было. Изменения иммунологических показателей на фоне проведения антимикотической терапии проанализировали у 5 больных АБЛА. Результаты представлены в табл. 2. Следует помнить, что целью терапии является не нормализация уровня общего IgE, а его снижение на 25-50%, ассоциированное с улучшением клинико-рентгенологических данных [12]. При повторном обследовании через 24 нед у всех больных отмечено статистически значимое снижение уровня общего IgE (p=0,04). Установлено снижение абсолютного числа эозинофилов у 4 (80%) пациентов и ослабление продукции ас^Е у 3 (60%) больных. Нормализовалось соотношение спонтанной и индуцированной выработки IFN-y у всех обследованных больных. Результаты нашего исследования совпадают с мнением многих авторов о том, что стратегия лечение АБЛА, которая включает не только глюкокортикостероиды, но и специфические антифунгальные препараты, наиболее эффективна. Применение итраконазола при АБЛА позволяет ослабить иммунный ответ в связи с уменьшением антигенной стимуляции, способствует восстановлению Th2/ Thl-дисбаланса, вызванного Aspergillus spp., и в ряде случаев дает возможность избежать или снизить потребность в стероидной терапии. Во многих странах, в том числе и в России, АБЛА часто не распознают вовремя. Поэтому очень важно, чтобы врачи разных специальностей помнили о возможности развития АБЛА у больных из групп риска. Сочетание характерных анамнестических данных и терапевтически резистентной БА должно стать основанием для направления больных в специализированные микологические и аллергологические клиники. В нашем исследовании установлено, что у всех больных АБЛА, включенных в исследование, выявлены плесневые грибы Aspergillus spp. в респираторных биосубстратах, существенно усилена активность ^2-типа, которую мы оценивали по уровням общего IgE, ас^Е, числу эозинофилов и значениям ИС IFN-y/IL-10 в ответ на стимуляцию клеток крови аллергеном A. fumigatus. Тенденция к нормализации иммунологического профиля больных на фоне клинических признаков улучшения состояния свидетельствует об успешном использовании антимикотической терапии у данной категории больных. Адекватная противовоспалительная и антимикотическая терапия способствует предотвращению прогрессирования этого тяжелого хронического заболевания легких и профилактике инвалидизации пациентов с АБЛА. Таблица 2. Динамика иммунологических показателей у больных АБЛА на фоне проведения антимикотической терапии Пациенты Показатели 1 2 3 4 5 Ме Lq-Hq 1 2 3 4 5 Ме Lq-Hq р Лейкоциты абс., х109/л 5,2 7,2 5,2 6,4 6,5 6,4 5,2-6,5 7,9 5,9 6,0 7,4 6,3 6,3 6,0-7,4 0,90 Лимфоциты абс., х109/л 1,04 2,88 1,20 2,24 0,91 1,20 1,04-2,24 1,11 2,12 1,26 2,07 1,45 1,45 1,26-2,07 0,89 Эозинофилы абс., х109/л 1,09 0,72 0,62 0,51 0,52 0,62 0,52-0,72 1,10 0,35 0,30 0,22 0,06 0,30 0,22-2,07 0,13 IgE, МЕд/мл 4650 1691 956 1014 960 1014 960-1691 723 285 205 75 57 205 75-285 0,04 асIgE Asp., МЕд/мл 6,47 17,96 18,00 1,25 4,14 6,47 4,14-17,96 10,56 14,32 15,6 1,01 4,96 10,56 4,96-14,32 0,83 IFN-y сп., пг/мл 5 99 7 14 81 14 7,0-81,0 2 8 6 5 0 5 2,0-6,0 0,04 IFN-y инд., пг/мл 910 1276 556 1220 659 910 659-1220 1018 2724 862 1648 1914 1648 1018-1914 0,04 Примечание: сп. - спонтанный; инд. - индуцированный. Российский Аллергологический ^^урнал № 6-2016 41 Оригинальные статьи

About the authors

Y I Kozlova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: kozlova510@mail.ru
St. Petersburg, Russia

A V Sobolev

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

E V Frolova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

A E Uchevatkina

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

L V Filippova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

O V Aak

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

O A Shurpitskaya

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

N N Klimko

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files