T-CELL IMMUNE RESPONSE TO SARS-COV-2 IN HEALTHCARE WORKERS 2.5-3 YEARS AFTER COVID-19

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

 По роду своей профессиональной деятельности медицинские работники (МР), во всех странах мира, находясь на переднем крае борьбы с COVID-19, наиболее часто подвергались инфицированию патогеном и переносили новую коронавирусную инфекцию (НКВИ) различной степени тяжести [1]. В связи с  биологической эволюцией вируса SARS-CoV-2 и появлением новых генетических субвариантов особое значение приобретает оценка долговременности и сохранности иммунной защиты в группе МР, актуальной задачей является также изучение длительности сохранения защитного потенциала вакцинации.

        Наряду с гуморальным клеточный иммунный ответ является крайне важным фактором в сдерживании SARS-CoV-2 [2, 3]. Мутации вируса в меньшей степени оказывают влияние на  клеточный иммунитет,  поскольку Т-клетки распознают короткие антигенные пептиды. На важность клеточного иммунного ответа указывает связь умеренного и тяжелого течения COVID-19 с частой выраженной лимфопенией [3]. При оценке Т-клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 распространение получил лабораторный метод  ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot) [4], при котором   используют наиболее иммуногенные шиповидный (S), нуклеокапсидный (N) [5, 6], мембранный (М) белки, а также структурные белки ORF-3a, ORF-7a [2].   Нуклеокапсидный (N) и спайковый белки (S) в ходе инфекции вызывают наиболее выраженный антительный ответ. Нейтрализующая активность антител (АТ), вырабатываемых против SARS-CoV-2, ассоциируется прежде всего с АТ к S-белку [5, 6]. АТ, специфически связывающиеся с RBD областью S1 субъединицы спайкового белка коронавируса, способны ингибировать его связывание с клеточными рецепторами, оказывая выраженный нейтрализующий эффект  [5, 7].  Нуклеокапсидный белок (N-белок) расположен во внутренней части вируса. Антитела к N-белку не обладают нейтрализующими свойствами , но их детекция  позволяет сделать вывод о готовности всех звеньев иммунной системы, в том числе Т-клеточного иммунного ответа, к противодействию вирусу.  [6, 7].  M белок – трансмембранный гликопротеин, является важным структурным белком коронавирусов [8]. M белок SARS-CoV-2 идентичен M белкам MERS-CoV и SARS-CoV на 39,2 и 90,1 % соответственно [9].  В технологии «ТиграТест® SARS-CоV-2» к отмеченным выше  S, N, М белкам  также добавлены вспомогательные белки SARS-CoV-2  ORF3a и ORF7a [4].  По данным исследований белки ORF7a и ORF3a SARS-CoV-2 опосредуют функцию  подавления  экспрессии MHC I класса  на инфицированных клетках, чтобы избежать элиминации цитотоксическими Т-клетками [10]. С обеспечением удобства использования и признания происхождения естественного иммунитета после перенесенной инфекции, от неинфицированных людей, получивших иммунопрофилактику вакциной, основанной только на S-белке,  в ТиграТест SARS-CoV-2  используются 2 пула пептидов: пептиды S-белка (ПАГ1) и смешанные пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a (ПАГ2) [4].     Иммунный ответ на пул пептидов S-белка SARS-CoV-2 в (ПАГ1) используется для оценки преимущественно поствакцинального иммунитета (если индивидуум не переболел COVID-19), а смешанные антигенные пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a (ПАГ 2) SARS-CoV-2 в большей степени отражают формирование естественного иммунитета [4].

    Технология ELISPOT позволяет визуализировать секретируемый эффекторной клеткой IFN- γ в ответ на её стимуляцию синтетическими пептидами SARS-CoV-2. Каждая такая клетка образует пятно (спот) на дне планшета. По количеству спотов оценивается напряжённость Т-клеточного ответа - количество специфических Т-клеток, что позволяет оценить уровень иммунной защиты на индивидуальном уровне. Тест-системы на данной платформе разрабатываются и производятся многими компаниями [11]: T-SPOT.COVID (Oxford Immunotec,Великобритания), SARS-COV-2 ELISPOT (AID, Германия), ELISpot Path (Mabtech, Швеция), Corona T-test (ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, Россия), «ТиграТест® SARS-CоV-2» (АО «ГЕНЕРИУМ», Россия) и др.

         ЦЕЛЬ  – изучить Т клеточный  иммунитет к иммуногенным пептидам вируса SARS-CoV-2 в группе МР ВИГ - реконвалесцентов  COVID-19 через 2,5- 3 года после перенесенной НКВИ с использованием технологии IGRA-ELISPOT.

          МЕТОДЫ                                                   

Дизайн исследования

Проведено обсервационное проспективное выборочное интервенционное  неконтролируемое исследование.

Исследования состояло из 4 этапов:

I этап – формирование исследуемых групп МР;

II этап – проведение  исследования Т клеточного иммунитета методом IGRA-ELISPOT с использованием «ТиграТест® SARS-CоV-2», («ГЕНЕРИУМ», Россия);

III этап – ранжирование количества спотов на 5 классов;

IV этап – анализ полученных результатов.

Критерии соответствия

Критерии включение:  МР ВИГ многопрофильной клинической больницы города Казани, перенёсшие COVID-19, получившие вакцинацию против COVID-19, а также невакцинированные. Диагноз и степень тяжести COVID-19 установлены в соответствии с действующими временными методическими рекомендациями «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» .

Условия проведения

Исследования проведены на базе Федерального бюджетного учреждения науки Казанский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.   

Продолжительность исследования

Исследования проведены в феврале-июне 2023 г., т.е. через 2,5-3 года от перенесенной НКВИ.

Описание медицинского вмешательства

Материалом для исследования служила цельная  кровь. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак с соблюдением правил асептики и антисептики.

Основной исход исследования

Показатели уровня Т клеточного  иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 в группе МР- реконвалесцентов COVID-19 ВИГ выявленные через 2,5- 3 года после перенесенной НКВИ с использованием технологии IGRA-ELISPOT.

Дополнительные исходы исследования

Не определяли

Анализ в подгруппах

В зависимости от тяжести перенесённой НКВИ МР, включенные в исследование, были рандомизированы на группы: 1 группа -  реконвалесценты легких форм- 41 человек (1a – 18 МР невакцинированные, 1 b – 23 МР получили вакцинацию против НКВИ), 2 группа – реконвалесценты  среднетяжелых/тяжелых форм COVID-19 - 37 человек (2а – 15 МР невакцинированные; 2b - 22 МР получившие вакцинацию против НКВИ), 3 группа -  больные с бессимптомным течение– 13 человек (все вакцинированы).

Методы регистрации исходов

После активации все клетки удаляли промыванием и для детекции цитокина добавляли  другие анти- IFN-γ антитела, конъюгированные c щелочной фосфатазой и узнающие другой эпитоп молекулы IFN-γ. Один спот (пятно) представляло собой отпечаток одной Т-клетки (CD4+и CD8+) периферической крови, секретирующей IFN-γ в ответ на стимуляцию антигенами SARS-CoV-2 [4, 12]. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из образцов цельной крови пациентов.

         Методика выполнения. Подготовку планшетов, порядок промывки стрипов, внесение образцов в планшеты, инкубацию МКПК с антигенами, внесение рабочего раствора конъюгата и проявление пятен проводили по согласно инcтрукции к набору реагентов тест системы  «ТиграТест® SARS-CоV-2» (ООО Генериум, Россия). Анализ состоял из четырех этапов (согласно инструкции к тест набору):

- 1 этап исследования -получение суспензии МКПК на градиенте плотности (1,077) и доведение клеточной суспензии до оптимальной концентрации (3,5 х 10⁵ кл/100 мкл );

- 2 этап- инкубация МКПК с 4 составляющими: ПАГ 1- пептиды S-белка; ПАГ 2 - пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7а, положительный контроль (К+), негативный контроль (К-);

- 3 этап-детекция цитокина с использованием анти-IFN-γ антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой и узнающие другой эпитоп молекулы IFN-γ;

- 4 этап- инкубация с хромогенным субстратом и образование пятна (спота), который является отпечатком одной Т-клетки, секретирующей IFN-γ.

          При оценке результатов в позитивном контроле количество спотов должно быть более 100, в негативном контроле допускается наличие до 14 спотов. Для определения количества пятен в лунках с антигенами  из числа спотов в ПАГ 1 и ПАГ 2 вычитали число спотов в К-. Результат теста рассматривали как отрицательный, если в результате анализа количество спотов как в лунке с ПАГ 1, так и в лунке с ПАГ 2, за вычетом количества пятен в отрицательном контроле, не превышало 10. Отрицательный результат показывает, что образец, вероятно, не содержит Т-клеток, специфически сенсибилизированных в отношении определённых антигенов коронавируса SARS-CоV-2. Результат теста рассматривали как положительный, если в результате анализа количество пятен как в лунке с ПАГ 1, так и в лунке с ПАГ 2, за вычетом количества пятен в К-, превышало 12. Положительный результат может потенциально свидетельствовать о сформировавшемся Т-клеточном иммунитете к вирусу SARS-CоV-2 в результате перенесённого заболевания COVID-19 (в том числе и в бессимптомной форме) и/или вакцинации [4].

Этическая экспертиза

Проведение исследования было одобрено ЛЭК ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (протокол от 28.04.2022), все МР подписали  информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ

   Статистическую обработку проводили методами вариационной статистики, используя статистический пакет Exсel и программный продукт «Prism GraphPad» (версия  10.4.1 (627) 2024 г.), в котором применяли методы сравнения: U-критерий Манна-Уитни, критерий Колмогорова-Смирнова. Различия считались значимыми при р <0,05.        

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследование были включены 91 МР ВИГ многопрофильной клинической больницы  г. Казани МЗ РТ, перенесших             COVID-19 в 1 и/или 2 волну пандемии в РФ. Все МР заполняли анкету, в которой указывались подробные анамнестические данные, в том числе о симптомах COVID-19 и вакцинации.

Основные результаты исследования  

Уровень Т клеточного иммунитета на пул пептидов S-белка и структурных белков (N, M, ORF3a, ORF7a) вируса SARS-CoV-2 у МР- реконвалесцентов COVID-19 через 2,5-3 года после перенесенной НКВИ.

       Уровень индивидуального иммунного ответа к пептидам S-белка SARS-CoV-2 (ПАГ 1) и структурным белкам N, M, ORF3a и ORF 7a (ПАГ 2) был вариабельным - от  13  до 100 и более спотов. Вариабельность показателей может определяться не только сформированным и сохранным Т клеточным ответом, но и инфекционной нагрузкой в условиях продолжавшейся пандемии, о чем свидетельствует более выраженный ответ на пул пептидов белков N, M, ORF3a и ORF7 вируса SARS-CoV-2.

        Для  оценки индивидуального Т-клеточного иммунитета на основе анализа литературы [16] и собственных данных, нами предложено ранжирование количества спотов на 5 классов: 0 класс- отрицательный результат; I класс (положительный результат низкого уровня)->12-20 спотов; II класс (положительный результат среднего уровня)- 21-40 спотов; III класс (положительный результат высокого уровня)- 41-100 спотов; IV класс (положительный результат очень высокого уровня) - более 100 спотов в лунке[12, 13, 14]

 

Рисунок 1 – Результаты исследования Т-клеточного ответа для одного субъекта с помощью «ТиграТест® SARS-CоV-2». Фотографии лунок планшета после инкубации : 1 - c пулом пептидов S-белка ( ПАГ1); б –  с пулом пептидов N, M, a ORF3a, ORF7a ( ПАГ 2); 3-  без специфического антигенного индуктора для определения  спонтанной продукции IFN- γ;  4 – c моноклональным антителом ОСТ-3 для определения  функциональной активности Т-лимфоцитов.

Figure 1 – Results of a T-cell response study for one subject using the TIGRA-Test SARS-CoV-2. Photos of the wells of the plate after incubation: 1 - with a pool of S-protein peptides (PAG1); b – with a pool of peptides N, M, a ORF3a, ORF7a (PAG 2); 3- without a specific antigenic inducer to determine the spontaneous production of IFN-γ;  4 – with monoclonal antibody OCT-3 to determine the functional activity of T-lymphocytes.

Результаты визуализации Т- клеточного ответа одного субъекта, представленные на рисунке 1, свидетельствуют об индуцированном выбросе  IFN-γ среднего уровня в ответ на пептиды S-белка и структурные белки N, M, ORF3a, ORF7a. Спонтанная продукция IFN-γ Т-лимфоцитами не превышает допустимого уровня. Способность индуцированной выработки IFN-γ соответствует установленному критерию. Результаты свидетельствуют о естественном и поствакцинальном Т клеточном иммунитете среднего уровня у данного субъекта.

   Распределение изучаемой когорты МР по выделенным классам представлено в таблице 1. Т лимфоциты, способные специфически реагировать на S-пептиды вируса SARS-CoV-2, были выявлены в 71,0 % (ПАГ 1), на пептиды N,M,ORF3a и ORF 7 в 87,0 %, соответственно в ПАГ 1 частота отрицательных результатов составила 29,0 %, в ПАГ 2 она был значительно ниже - 13,0 % (p<0,05). В ПАГ 1 превалирующими были I и II классы (низкий и средний уровни), в целом, они составили 52,0 %. В ПАГ 2 - II и III классы (средние и высокие уровни) составили 62 %.  Наиболее частая встречаемость результатов высокого и среднего уровня Т клеточного ответа на пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7, как и превалирование Т лимфоцитов, способных  реагировать на антигены N, M, ORF3a и ORF 7 (87 % против 71,0 % p <0,05) свидетельствует о более эффективной сохранности естественного иммунитета по сравнению с поствакцинальным при долговременном мониторинге.

Таблица 1 – Частота распределения медицинских работников- реконвалесцентов COVID-19  в зависимости от показателей Т клеточного  иммунитета к пулу пептидов S-белка SARS-CoV-2 (ПАГ 1) и  структурных белков  N, M, ORF3a и ORF 7a (ПАГ 2)

           Table 1 – Frequency of distribution of convalescent medical workers of COVID-19 depending on the indicators of T cell immunity to the pool of SARS-CoV-2 S-protein peptides (PAG 1) and structural proteins N, M, ORF3a and ORF 7a (PAG 2)

Пептидные антигены белков SARS-CoV-2	Доля медицинских работников с ранжированным по классам уровнем Т клеточного иммунитета
	0  класс отрицательный результат   (0-11 спотов в лунке), %	I  класс положительный низкий уровень (12-20 спотов в лунке), %	II  класс положительный средний уровень (21-40 спотов в лунке), %	III класс положительный высокий уровень (41-100 спотов в лунке), %	IV класс положительный очень высокий уровень (более 100 спотов в лунке),  %
ПАГ 1	29,0	27,0	25,0	13,0*	3,0*
ПАГ 2	13,0	16,0	38,0	24,0*	8,0*

      

 

 

*- достоверные различия между группами (p<0,05)

*- significant differences between groups (p<0.05)

 Т клеточный иммунный ответ на пептиды S-белка и пептиды N, M, ORF3a и ORF7a  у МР - реконвалесцентов COVID-19 в зависимости от тяжести перенесенной НКВИ.

            Максимальная частота отрицательных результатов на пептиды S-протеина регистрировалась при легкой и бессимптомной форме НКВИ (группы 1 и 3 соответственно 37,2±3,5% и 38,0±4,5%), минимальная - при тяжелой/среднетяжелой форме COVID-19 - 14,0±6,5%, p<0,05; (по сравнению с группами 1 и 3). Нами было отмечено снижение частоты реакций I класса (низкий положительный уровень) у МР, перенесших среднетяжелую/тяжелую форму НКВИ (группа 2) (у них регистрировалось 23,0±2,5%), по сравнению с МР перенесшим легкую форму COVID-19 (группа 1) (у них регистрировалось 35±3,5%) (p<0,05), (рисунок 2). Максимальная частота положительных результатов в ТиграТест SARS-CoV-2  к пептидным антигенам S-белка (классы II - 34,0 %, III - 20,0 %,  и IV - 9,0 %) регистрировалась при среднетяжелом/тяжелом течении НКВИ у МР, по сравнению с легким течением (классы II - 19,0±2,5 %; III - 12,0±4,5 %; IV - 2,0±1,5 %), (рисунок 2). Таким образом, сохранность Т клеточного ИО при среднетяжелом/тяжелом течении НКВИ , по сравнению с легким течением была выше.

В  группе МР с бессимптомными формами COVID-19 частота положительных результатов в «ТиграТест® SARS-CоV-2»  на антигены ПАГ I вируса SARS-CoV-2 составила 62,0±5,5 %, что сопоставимо с значениями, полученными при легком течении НКВИ (COVID-19) - 63,0±6,5%, (p>0,05). Частота положительных реакций I и II классов в «ТиграТест® SARS-CоV-2» на антигены ПАГ I вируса SARS-CoV-2 между группами МР с легким и бессимптомным течением НКВИ была сопоставимой и составляла от 23,0±5,5  до 31,0±5,5 % и от 19,0±5,5% до 23,0±5,5 % соответственно. Выявленное нами значимое снижение Т клеточного ИО к антигенам вируса SARS-CoV-2 в группе МР с бессимптомным течением НКВИ (группа 3) подтверждалась снижением частоты регистрации реакций III и IV классов и составила от 8,0±5,5  % до 12,0±2,5  % и от 0 до 2,0±2,5%, рисунок 2.       

Рисунок 2 – Распределение медицинских работников по классовому уровню Т-клеточного иммунного ответа на пептиды S-белка (ПАГ 1) в «ТиграТест® SARS-CоV-2» в зависимости от  тяжести перенесенной COVID-19. По оси ординат: частота распределения медицинских работников, в % ; По оси абсцисс: Т клеточный иммунный ответ на пептиды S-белка (ПАГ 1), ранжированный от 0 до IV класса  в группах медицинских работников : Группа 1 Реконвалесценты легких форм COVID-19, n=41; Группа 2 Реконвалесценты среднетяжелых/тяжелых форм COVID- 19, n=37; Группа 3 Перенесшие бессимптомные формы COVID- 19, n=13.

Figure 2 – Distribution of medical workers by class level of T-cell immune response to S-protein peptides (PAG 1) in «TIGRA-Test SARS-CoV-2», distributed according to the severity of COVID-19. On the ordinate: frequency of distribution of medical workers, in%; On the x-axis: T cell immune response to S-protein peptides (PAG 1), ranked from 0 to class IV in groups of HCWs: Group 1 Convalescents of mild forms of COVID-19, n=41; Group 2 Convalescents of moderate/severe forms of COVID-19, n=37; Group 3 Those who had asymptomatic forms of COVID-19, n=13.

 

При изучении Т клеточного ИО на пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a (ПАГ2) вируса SARS-CoV-2 установлена минимальная частота (9,0±4,5%) отрицательных результатов (реакции 0 класса) в «ТиграТест® SARS-CоV-2» в группе МР реконвалесцентов среднетяжелых/тяжелых форм НКВИ (рисунок 3), при этом у МР перенесших бессимптомные формы СOVID-19 (группа 3) частота отрицательных результатов была выше на 14,0%, чем при клинически манифестной форме инфекции, p<0,05. В группе МР реконвалесцентов среднетяжелых/тяжелых форм, по сравнению с МР реконвалесцентами легких форм НКВИ частота регистрации значений Т клеточного иммунного ответа  в «ТиграТест® SARS-CоV-2»,  относящихся к I классу, была ниже в 4,0 раза. При перенесенных среднетяжелых/тяжелых форм НКВИ нами была отмечена высокая частота регистрации у МР положительных результатов реакций, относящихся к II (46,0±7,5 %), III (31,0±5,5 %), и IV (8,0±3,5%) классам, по сравнению с МР перенесшими легкие формы НКВИ, рисунок 3. Таким образом, у МР, которые перенесли среднетяжелые/тяжелые формы НКВИ по сравнению с легкими формами, через 2,5- 3 года регистрировалась меньшая частота отрицательных значений и высокая частота положительных ранжированных результатов показателей Т клеточного ИО на пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a вируса SARS-CoV-2. Сохранность реакций Т клеточного ИО на пептиды S-белка и пептиды N,M,ORF3a и ORF7a  вируса SARS-CoV-2 зависела от степени тяжести перенесенной НКВИ. При бессимптомной форме сохранность Т клеточного ответа была сопоставима с легкой формой инфекции.

    Рисунок 3 – Распределение медицинских работников по классовому уровню Т-клеточного иммунного ответа на пептиды N, M, ORF3a и ORF7а (ПАГ 2) «ТиграТест® SARS-CоV-2» в зависимости от тяжести перенесенной COVID-19. По оси ординат: частота распределения медицинских работников, в % ; По оси абсцисс : Т клеточный иммунный ответ на пептидные антигены N, M, ORF3a и ORF7а (ПАГ 2), ранжированный от 0 до IV класса  в группах медицинских работников: Группа 1- реконвалесценты легких форм COVID-19, n=41; Группа 2 реконвалесценты среднетяжелых/тяжелых форм COVID- 19, n=37; Группа 3 - перенесшие бессимптомные формы COVID- 19, n=13.

Figure 3 – Distribution of medical workers by class level of T-cell immune response to N, M, ORF3a и ORF7а -protein peptides (PAG 2) in «TIGRA-Test SARS-CoV-2», distributed according to the severity of COVID-19. On the ordinate: frequency of distribution of medical workers, in%; On the x-axis: T cell immune response to N,M,ORF3a и ORF7a -protein peptides (PAG 2), ranked from 0 to class IV in groups of HCWs: Group 1 Convalescents of mild forms of COVID-19, n=41; Group 2 Convalescents of moderate/severe forms of COVID-19, n=37; Group 3 Those who had asymptomatic forms of COVID-19, n=13.

Особенности Т клеточного иммунного ответа на SARS-CoV- 2 у МР- реконвалесцентов НКВИ COVID-19 в зависимости от вакцинального статуса

          По полученным нами данным, при гибридном иммунитете (при клинически манифестных формах) частота отрицательных результатов на пептиды S-белка в ТиграТест SARS-CoV-2  - в группах МР – реконвалесцентов легких форм НКВИ, вакцинированных (47,4±5,5%) и реконвалесцентов среднетяжелых форм НКВИ, регистрируется реже по сравнению с постинфекционным (рисунок 4). Необходимо отметить, что в группе МР вакцинированных реконвалесцентов легких форм НКВИ, (группа 1b), по сравнению c  невакцинированными реконвалесцентами МР легких форм НКВИ, (группа 1а), положительные реакции I, II, III и IV классов регистрировались чаще в 1,3-4,2 раза соответственно. В группе МР  реконвалесцентов среднетяжелых форм НКВИ, вакцинированных (группа 2b), по сравнению c МР реконвалесцентами среднетяжелых/тяжелых форм COVID-19, невакцинированных (группа 2а) положительные реакции I,  II, III, IV классов в ТиграТест SARS-CoV-2 регистрировались  чаще в 1,2-1,8 раз, рисунок 4. Таким образом, через 2,5-3 года после перенесенной НКВИ сохранность гибридного Т клеточного иммунитета на пептиды S-белка значительно выше, по сравнению с постинфекционным, как при легком, так и при среднетяжелом течении инфекции.

Сопоставление результатов гибридного Т клеточного ИО на пептиды S-белка между бессимптомными и клинически манифестными формами инфекции показало, что частота отрицательных результатов «ТиграТест® SARS-CоV-2» у вакцинированных МР, перенесших бессимптомные формы COVID- 19, (группа 3 - 38,5±7,5%) была выше чем у вакцинированных МР реконвалесцентов легких форм COVID-19,  (29,2±1,5%) и вакцинированных реконвалесцентов среднетяжелых форм COVID-19, (13,6±2,5 %), p<0,05, рисунок 4. Сохранность гибридного иммунитета на пептиды S-белка при долговременном мониторинге при бессимптомном течении, в отличие от легкого, характеризовалась более высокой частотой отрицательных и низкой частотой результатов высокого и очень высокого уровня.

            Рисунок 4 – Распределение медицинских работников по классовому уровню Т-клеточного иммунного ответа на пептиды S- белка ( ПАГ1)  в зависимости от степени тяжести COVID-19 и вакцинального статуса. По оси ординат: частота распределения медицинских работников, в % ; По оси абсцисс: Т клеточный иммунный ответ на пептидные антигены S - белка ( ПАГ 1) , ранжированный от 0 до IV класса  в группах медицинских работников : Группа 1а Реконвалесценты легких форм COVID-19,невакцинированные;  группа 1 b – реконвалесценты легких форм COVID-19, вакцинированные ; Группа 2а Реконвалесценты среднетяжелых/тяжелых форм COVID- 19, невакцинированные; группа 2 b – реконвалесценты среднетяжелых форм COVID-19, вакцинированные; Группа 3- Перенесшие бессимптомные формы COVID- 19, вакцинированные.

Figure 4 – Distribution of medical workers by class level of T-cell immune response to S-protein peptides (PAG1) depending on the severity of COVID-19 and vaccine status. On the ordinate: frequency of distribution of medical workers, in%; On the x-axis: T cell immune response to S-protein peptide antigens (PAG 1), ranked from class 0 to class IV in groups of medical workers: Group 1a Convalescents of mild forms of COVID-19, unvaccinated;  group 1 b – convalescents of mild forms of COVID-19, vaccinated; Group 2a Convalescents of moderate/severe forms of COVID-19, unvaccinated; group 2 b – convalescents of moderate forms of COVID-19, vaccinated; Group 3 - Those who have had asymptomatic forms of COVID-19 and have been vaccinated.

 

При клинически манифестных формах НКВИ реже регистрировались отрицательные значения  результатов ТиграТест SARS-CoV-2 на антигены N,M,ORF3a, ORF7a  у вакцинированных МР реконвалесцентов легких форм COVID-19, (группе 1b)  по сравнению с  невакцинированными МР реконвалесцентами легких форм COVID-19, (группой 1а), рисунок 5. Таким образом, при длительном наблюдении у МР отмечена более высокая сохранность Т клеточного гибридного иммунитета на пептиды N, M, ORF3a и ORF7a , ассоциированная преимущественно с тяжелым/среднетяжелым течением перенесенной НКВИ.

Рисунок 5 – Распределение медицинских работников по классовому уровню Т-клеточного иммунного ответа на пептиды структурных белков N,M,ORF3a и ORF7a ( ПАГ2) в зависимости от степени тяжести COVID-19 и вакцинального статуса. По оси ординат: частота распределения медицинских работников, в % ; По оси абсцисс : Т клеточный иммунный ответ на структурные белки N,M,ORF3a и ORF7a (ПАГ2), ранжированный от 0 до IV класса  в группах медицинских работников: Группа 1 Реконвалесценты легких форм COVID-19,невакцинированные;  группа 1 b – реконвалесценты легких форм COVID-19, вакцинированные ; Группа 2 Реконвалесценты среднетяжелых/тяжелых форм COVID- 19, невакцинированные; группа 2 b – реконвалесценты среднетяжелых форм COVID-19, вакцинированные; Группа 3- Перенесшие бессимптомные формы COVID- 19, вакцинированные.

Figure 5 – Distribution of medical workers by class level of T-cell immune response to N,M,ORF3a и ORF7a -protein peptides (PAG2) depending on the severity of COVID-19 and vaccine status. On the ordinate: frequency of distribution of medical workers, in%; On the x-axis: T cell immune response to N,M,ORF3a и ORF7a -protein peptide antigens (PAG 2), ranked from class 0 to class IV in groups of medical workers  Group 1a Convalescents of mild forms of COVID-19, unvaccinated;  group 1 b – convalescents of mild forms of COVID-19, vaccinated; Group 2a Convalescents of moderate/severe forms of COVID-19, unvaccinated; group 2 b – convalescents of moderate forms of COVID-19, vaccinated; Group 3 - Those who have had asymptomatic forms of COVID-19 and have been vaccinated.

Нежелательные явления

Отсутствовали

 ОБСУЖДЕНИЕ

Выявленная нами частая встречаемость результатов высокого и среднего уровня Т клеточного иммунного ответа на пептиды N, M, ORF3a и ORF7, как и преобладание Т лимфоцитов, способных  реагировать на антигены N, M, ORF3a и ORF7a (87% против 71,0%, p<0,05) свидетельствует о более эффективной сохранности естественного иммунитета по сравнению с поствакцинальным при долговременном мониторинге в группе МР. Выявленный нами более высокий  уровень встречаемости циркулирующих в периферической крови у МР Т- лимфоцитов,  способных  реагировать на антигены N, M, ORF3a и ORF 7а SARS-CoV-2, также  может формироваться у индивидуума при инфицировании другими бета-коронавирусами, которые индуцируют длительный Т-клеточный иммунный ответ против общего структурного для них N-белка, что было подтверждено в ранее проведенных исследованиях [4, 11].

Таким образом, вариабельность показателей Т-клеточных тестов может определяться не только сформированным и сохранным Т-клеточным ответом, но и эпизодической инфекционной нагрузкой, о чем свидетельствует более выраженный иммунный ответ на пул пептидов N, M, ORF3a и ORF7a вируса SARS-CoV-2. Полученные нами данные согласуются с данными других исследователей, в которых показана вариабельность Т-клеточного специфического иммунитета. Так, в работе А.П. Топтыгиной (2023) установлено, что клеточный иммунитет к пептидному антигену S-белка вируса SARS-CoV-2 значимо различается по уровням: 50,0% обследованных лиц имели высокий клеточный иммунитет и столько же - низкий [15]. Выявленное нами значимое снижение Т клеточного ИО к антигенам вируса SARS-CoV-2 в группе МР с бессимптомными формами НКВИ  подтверждалась снижением частоты регистрации реакций III и IV классов. В проведенных ранее исследованиях Т-клеточный иммунитет у серонегативных лиц с бессимптомным течением COVID-19  обнаружен у  41 % обследуемых[19].  Полученные нами данные о максимальной частоте отрицательных результатов на пептиды S-протеина  при легкой и бессимптомной форме НКВИ, минимальные - при тяжелой/среднетяжелой форме НКВИ (COVID-19) соотносятся с данными исследований, показавших высокий уровень специфичных к S-белку Т-клеток памяти при тяжелой форме инфекции, если такие клетки обнаруживались сразу после перенесённого заболевания [17, 18], на протяжении 9 и более месяцев, а также о формировании и сохранности определенных уровней Т клеточного ответа, в том числе, и при лёгких формах COVID-19 [15, 16, 19]. Через 2,5-3 года после перенесенной НКВИ сохранность гибридного Т клеточного иммунитета на пептиды S-белка  и на пептиды N, M, ORF3a и ORF7значительно выше, по сравнению с постинфекционным, как при легком, так и при среднетяжелом течении инфекции, что соотносится с данными  представленными другими исследовательскими группами[15, 16]

Резюме основного результата исследования

 У большинства медицинских работников временного инфекционного госпиталя адаптивный Т-клеточный иммунный ответ  к пептидам S - белка и структурным пептидам N, M, ORF3a и ORF7a вируса SARS-CoV-2 сохраняется через 2,5-3 года после перенесенной НКВИ, напряженность  ассоциируется со степенью тяжести COVID-19. Отсутствие Т-клеточного иммунного ответа к S-белку на этих сроках выявлено в 29,0% случаев, а к пулу структурных антигенов N, M, ORF3a и ORF7a  вируса SARS-CoV-2 - в 13,0% .

Ограничения исследования    

  Ограничение исследования связано с возможностями свободной циркуляции вируса SARS-COV-2  в условиях продолжавшейся пандемии на момент проведения исследования, что приводило к естественному бустированию, поэтому нельзя с точностью сказать, как долго поддерживался бы Т клеточный иммунитет к вирусу SARS-CoV-2 при отсутствии циркуляции возбудителя. Исследование проведено спустя 2,5- 3 года после впервые перенесенной НКВИ, целесообразно продолжение изучения дальнейшей динамики Т клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 для уточнения сроков его снижения и персонализации специфической профилактики.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Т клеточный иммунитет к S-белку и пулу структурных антигенов N, М, ORF-3a и ORF-7a вируса SARS-CoV-2 сохраняется на протяжении 2,5-3 лет после перенесенной НКВИ в 71 % и 87 % соответственно. Т клеточный ответ к S-пептиду SARS-CoV-2 и пептидам N,M,ORF3a и ORF7а у МР- реконвалесцентов COVID-19 отличается значительной вариабельностью. Установленное эмпирическим путем  ранжирование количества спотов в классах может использоваться для оценки индивидуального клеточного иммунитета и стратификации рисков повторного инфицирования у МР. Через 2,5-3 года после перенесенной НКВИ отмечается более эффективная сохранность естественного Т клеточного иммунитета по сравнению с поствакцинальным. Отрицательный результат Т клеточного иммунного ответа к антигену шиповидного S протеина может быть основанием для решения вопроса о повторной вакцинации МР. Сохранность Т клеточного ответа на пептиды S-белка и пептиды N, M, ORF3a и ORF7a ассоциирована со степенью тяжести перенесенной НКВИ: более высокий уровень  Т клеточного иммунитета на антигены вируса SARS-CoV-2 при долговременном мониторинге отмечается у МР, которые перенесли среднетяжелые/тяжелые формы COVID-19. При бессимптомной форме сохранность Т клеточного ответа на пептиды S-белка  и пептиды N,M,ORF3a и ORF7a сопоставима с легкой  формой НКВИ. Сохранность параметров гибридного иммунитета по сравнению с постинфекционным выше, что является значимым как для групп с клинической манифестацией НКВИ в анамнезе, так и для группы с бессимптомными формами.

About the authors

Irina Reshetnikova

Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan (Volga Region) Federal University Ministry of Education of Russia

Author for correspondence.
Email: reshira@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3584-6861

Director for Scientific Work of Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Associate Professor of the Kazan (Volga Region) Federal University Ministry of Education of Russia

Россия

YU Tyurin

ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора

Email: tyurin.yurii@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2536-3604

доктор медицинских наук 

Россия, Казань, Большая Красная улица, 67

Rustem Fassakhov

профессор кафедры внутренних болезней ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Минобрнауки РФ

Email: farrus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9322-2689

профессор кафедры внутренних болезней 

Россия

Elena V Agafonova

ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора

Email: agafono@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4411-8786

кандидат медицинских наук, врач лабораторной диагностики

References

Supplementary files