Especially the expression of membrane markers of b - lymphocytes in seropositive option, the current articular and visceral form of rheumatoid arthritis

Abstract

Full Text

Серопозитивный вариант ревматоидного артрита (РА) характеризуется потерей В - клеточной толерантности, приводящей к синтезу широкого спектра аутоантител, синтезу ревматоидного фактора (РФ), к активации системы комплемента, Т - лимфоцитов и развитию воспаления и деструкции тканей организма. Учитывая, что продуцентами РФ являются В - лимфо - циты и что серонегативный вариант характеризуется отсутствием РФ, а также неоднородностью субпопуляций В - клеток актуальным является вопрос о динамики субпопуляций В - лимфоцитов их дифференцировки и созревания при серонегативном варианте РА, степени экспрессии мембранных маркеров их функциональной активности при серонегативном варианте. Целью работы является изучение особенностей иммунофенотипа В - лимфоцитов на раз ных этапах иммуногенеза, при серонегативном варианте течения суставной и висцеральной формы ревматоидного артрита (РА). Материалы и методы Обследовано 38 пациентов с серонегативным вариантом и висцеральной формой РА, в стадии обострения, вторая степень активности, медленно прогрессирующее течение. Средний возраст обследуемых 54±5 года. Диагноз устанавливался на основании диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации 1987 года и классификации Ассоциации ревматологов России 2007 года. Пациенты были разделены на две группы по вариантам течения. Первую группу составили 23 больных, с суставной формой течения РА. Вторую группу - 15 больных с висцеральной формой. Контрольную группу составили 10 практически здоровых доноров в возрасте 40 - 50 лет. Р оссийский Аллергический Журнал 97 Сизякина Л.П., Харитонова М.В. Изучение иммунофенотипа В - лимфоцитов проводили по экспрессии мембранных антигенов: CD19+CD5+CD45+ (В - 1 лимфоциты), CD19+CD5 - CD45+ (зрелые В2 - лифоциты), CD19+CD45RA+CD27 - CD45+ (наивные В - 2), CD19+CD45RÄ - CD27+CD45+ (В2 - клетки памяти), CD19+CD23+CD45+, CD19+C - D25+CD45+ (маркеры ранней активации), CD19+CD40+CD45+, CD19+CD86+CD45+ (ко - стимулирующие молекулы), CD19+An+CD45, CD19+CD95+CD45+ (готовность В - лимфоцитов к апоптозу), а также CD3+CD4+CD40L+CD45+ (лиганд для взаимодействия Т - лимфоцитов с В - клетками), методом проточной цитометрии с использованием однопараметрических моноклональных антител, фирмы производителя Beckman Coulter. Функциональную активность В - лимфоцитов изучали по уровню содержания сывороточных иммуноглобулинов классов A.,M.,G в реакции радиальной иммунодифффу - зии в геле по Манчини, (Manchini et al., 1965г.), а также исследовали количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле 6000 (ПЭГ) (Гриневич Ю.А. с соавт., 1981). Математическую обработку полученных данных проводили на ПК Microsoft Windows XP professional, используя программу «Statistica 7.0». Достоверность различий в группах оценивали с помощью непараметрических критериев Манна - Уитни и Вилкоксона. Достоверными считались результаты при p<0,05. Результаты и обсуждение При анализе содержания В - лимфоцитов в группе пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА по сравнению с группой контроля, выявлено статистически достоверное увеличение популяции В1 - лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5+CD3 - CD45+ (0,58±0,09% и 0,12 ±0,03%) и В2 - клеток с иммунофенотипом CD19+CD5 - CD3 - CD45+(11,23±1,16% и 8,0±0,45%). При этом в процентном соотношении субпопуляции В - клеток распределились слудующим образом: В1 - лимфоциты 5,16%, В2 - лимфоциты 94,8%. При изучении степени зрелости В - клеток, выявлено увеличение количества наивных В2 - клеток с фенотипом CD19+CD45RA+CD27 - CD45+ (8,60±1,10 % и 5,65 ±0,46%), тогда как клетки памяти CD19+CD45RA - CD27+ CD45+ не отличались от донорских значений. Данный факт иллюстрируется увеличением индекс соотношения наивных В - 2 клеток к В - 2лимфоцитам памяти (3,0±0,36 у.е. и 2,36±0,20 у.е.). Процесс активации В2 - лимфоцитов определяется экспрессией мембранных структур, обеспечивающих восприятие и проведение сигнала внутрь клетки приводящий к изменениям её функциональной активности. Анализ активационных маркеров выявил увеличение экспрессии на В2 - клетках маркеров ранней CD19+CD23+CD45 (2,23±0,46 % и 0,91±0,14 %), CD19+CD25+CD45+ (0,58±0,15 % и 0,05±0,01 %) активации и молекулы ко - стимуляции CD19+CD86+CD45+ (1,07±0,24% и 0,1±0,01%). При анализе Т - В - клеточной кооперации осуществляющейся через костимулирующий сигнал и представленный системой CD40L и CD40 при суставной форме серонегативного РА выявлено отсутствие изменений экспрессии кости - мулирующей молекулы CD19+CD40+CD45+ (8,14±0,96 % и 7,02 ±0,42%) на В2 лимфоцитах, при этом увеличена экспрессия CD40L лиганда на Т - хелперах CD3+CD4+CD45+ (0,63±0,12% и 0,3 ±0,05%). Угнетение и элиминация активированных клеток сопровождается запуском процессов апоптоза. Для восприятия апоптотического сигнала на мембране В2 - клеток имеется рецептор CD95, при его изучении выявлено увеличение экспрессии рецептора CD19+CD95 - CD45+ готовности к апоптозу (1,04±0,37% и 0,33 ±0,03% соответственно) и количеством апоптотирующих В - клеток CD19+An+CD45+ (1,55±0,24% и,50 ±0,03%) в реакции с анексинном - V. Суммарная интеграция работы В - 1и В - 2 клеток привела к повышению синтеза сывороточных иммуноглобулинов классов ^А, ^М (^А 2,17±0,13 г\л и 1,13±0,01г\л, ^М - (1,38±0,09г\л и 1,07±0,02г\л соответственно) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (103,0±11,88 у.е. и 65,15±1,83у.е.), что свидетельствует об активации плазматических клеток. При этом количество сывороточного иммуноглобулина класса IgG не отличалось от референтных значений, что может свидетельствовать о нарушениях процессов межклеточного взаимодействия. 98 Р оссийский Аллергический Журнал Особенности экспрессии мембранных маркёров В - лимфоцитов при серонегативном варианте течения суставной и висцеральной форме ревматоидного артрита Исследуя степень зрелости В2 - лимфоци - тов при серонегативном варианте висцеральной формы РА по сравнению с группой контроля, выявлено статистически достоверное увеличение популяции наивных В2 - клеток CD19+CD45RA+CD27 - CD45+ (8,18±1,80 и 5,65 ±0,46), тогда как В2 клетки памяти CD19+CD45RÄ - CD27+ CD45+ не отличались от показателей контрольной группы. Данную особенность отражает увеличение индекса соотношения наивных В - 2 клеток к В - 2лимфо - цитам памяти (3,70 ± 0,50 у.е. и 2,36±0,20 у.е.). При этом общее содержание зрелых В - клеток CD3 - CD19 +CD45+ не отличалось от показателей группы доноров. Анализируя количество В1 - лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5+CD45+ в данной группе, выявлено статистически достоверное их увеличение по сравнению с группой контроля (0,75±0,11 и 0,12±0,03). От общего количества зрелых В - клеток минорная субпопуляция В1лимфоцитов CD19+CD5+CD45+ составила 7%, а В2 - клеток 93%. Исследуя активационный потенциал В2 - лимфоцитов выявлено увеличение экспрессии маркеров ранней активации CD19+CD23+CD45+(2,72±0,86 и 0,91 ±0,14), CD19+CD25+CD45+ (0,31±0,17 и 0,05 ±0,01) и ко - стимулирующей молекулы CD19+CD86+CD45+ (2,12 ±0,44 и 0,13 ±0,01), что отражает способность клетки к дифферен - цировке и пролиферации. В2 - лимфоциты в развитие иммунного ответа выступают в роли антиген представляющей клетки, и данная функция реализуется экспрессией мембранного антигена HLA DR. Степень экспрессии на CD19+CD5 - CD45+ не отличалась от референтных значений (9,78±1,3 и 7,39±0,41). Дальнейшая реализация иммунного ответа обеспечивается межклеточным взаимодействием мембранной молекулы В лимфоцитов CD40 с мембранной молекулой Т - хелперов CD40L, данное взаимодействие реализуется переключением иммуноглобулинов с класса IgM на IgA, IgG. При серонегативном варианте висцеральной формы РА экспрессия CD40 на В2 - клет - ках не отличалась от показателей контрольной группы, тог да как экспрессия Т - хелперов CD3+CD4+CD45+ (50,67 ± 2,47 и 42,05±0,35) и лиганда CD4+CD40L+CD45+ на них (0,66±0,22 и 0,29 ±0,05) были статистически выше. При оценке процесса элиминации активированных клеток выявлено увеличение экспрессии рецептора CD19+CD95 - CD45+ готовности к апоптозу (0,66±0,38% и 0,33 ±0,03%) и количеством апоптотирующих В - клеток CD19+An+CD45+ (1,11±0,10% и,50 ±0,03%) в реакции с анексинном - V. Изучение функции антителообразования В2 - лимфоцитами показало увеличение содержания сывороточных иммуноглобулинов классов ^А, IgM (^А 1,99 ±0,23 г\л и 1,13±0,01г\л), IgM - (1,57 ± 0,19 г\л и 1,07±0,02г\л соответственно), при этом количество ЦИК и сывороточного иммуноглобулина класса Ig G не имело статистически достоверных изменений. Таким образом при сравнительном анализе относительного количества и иммунофенотипа В1 и В2 - лимфоцитов, в группах с различными формами РА установлено, что относительное количество В1 - клеток имеет тенденцию к увеличению при серонегативной висцеральной форме РА, а количество В2 - кле - ток при серонегативной суставной форме РА. Популяция клеток с фенотипом В1 лимфоцитов обладает рядом свойств: долгоживущие, самовозобновляющиеся, синтезируют аутоантитела, имеют низкое сродство своих иммуноглобулиновых рецепторов к антигенам, что позволяет им перекрестно реагировать со многими сходными детерминантами. [3, 5]. При анализе процессов созревания выявлено нарушение процессов дифференцировки в сторону увеличения наивных В2 - клеток при висцеральной форме РА, что свидетельствует о повышенной готовности распознавать антиген с последующей дифференцировкой их в плазматические клетки и синтезу иммуноглобулинов и поддержанию пула аутореактивных антител. Процесс активации В - 2 клеток характеризуется статистически достоверным усилением экспрессии ко - стиму - лирующей молекулы CD86, при этом процесс межклеточной кооперации характеризуется, снижением экспрессия CD40 и одновременно усилением экспрессии CD40L и проявляется нарушением полноценного взаимодействия В и Т - лимфоцитов, отсутствием переключе Р оссийский.^Аллергический ^Журнал 99 Синяков А.А., Смирнова О.В., Даренская М.А.,Титова Н.М. ния изотипов иммуноглобулинов при серонегативном варианте висцеральной формы РА. Данный факт в исследовании иллюстрируется отсутствием изменения количества иммуноглобулинов класса G. Выявлено статистически достоверное снижение процесса апоптоза при висцеральной форме РА, что свидетельствует о нарушении процессов угнетения чрезмерной активации и элиминации поликлональных В - клеток.