Fagotsitarnaya aktivnost' monotsitov krovi v otvet na metitsillinrezistentnye shtammy staphylococcus aureus u bol'nykh polipoznym rinosinusitom

Abstract

Full Text

Полипозный риносинусит - это хроническое заболевание слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, имеющее в основе патогенеза воспалительную реакцию, в которой в зависимости от формы воспаления могут доминировать эозинофилы или нейтрофилы [1]. Распространенность его в популяции достаточно велика. Колонизация золотистого стафилококка на слизистой оболочке носа приводит к образованию суперантигенного токсина, который усиливает местное эозинофильное воспаление и образование полипов [1, 2, 3]. Метициллинрези - стентый стафилококк (MRSA) относиться к бе - та - лактамазам расширенного спектра. Наиболее часто именно с ним связанны внутрибольничные (нозокомиальные) инфекции [4]. Известно, что уровень летальности при бактериемиях, вызываемых MRSA, выше, чем при инфекциях, обусловленных чувствительными штаммами. Вместе с тем установлено, что в процессе эволюции стафилококки приобрели способность к угнетению фагоцитарной функции лейкоцитов крови путем блокирования опсонизирующих веществ (комплемента и иммуноглобулина G), а также путем непосредственного токсического действия на фагоциты [5, 6, 7]. Фагоцитоз является одной из главных систем защиты организма от чужеродных агентов и играет важную роль при гнойно - воспалительных заболеваниях, особенно при стафилококковой инфекции. Активированные моноциты являются мощными эффекторами и запускают механизмы каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Моноциты первыми мобилизуются в очаг воспаления и, от их фагоцитарной активности зависит элиминация возбудителя [1, 2, 3]. Несмотря на интенсивность исследований в данном направлении, остается все еще малоизученным весь спектр, происходящий внутриклеточных событий, связанных с изменением фенотипических характеристик и функционирования моноцитов при воздействии бактериальных агентов, в том числе чувствительных и резистентных к действию антибиотиков. Целью исследования является оценка фагоцитарной активности моноцитов крови при воздействии метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus относительно чувствительных штаммов у больных полипозным риносинуситом. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследования служили моноциты крови, выделенные у больных полипозным Р оссийский.^Аллергический ^Журнал 47 Коленчукова О.А., Лазарева А.М., Смирнова С.В., Сарматова Н.И., Добрецов К.Г. риносинуситом в возрасте от 25 до 45 лет (n=38) и штаммы Staphylococcus aureus устойчивые к действию оксациллина (метициллина) (MRSA) в виде живой суспензии в концентрации 106 КОЕ/мл. В качестве контроля использовались штаммы Staphylococcus aureus чувствительные к действию метициллина (MSSA) в аналогичной концентрации. для выявления метициллинрезистентности Staphylococcus aureus использовали метод скрининга на агаре. для проведения скрининга использовали агар Мюллера - Хинтон, содержащий 4% NaCl и 6,0 мкг/мл метициллина. Микробную взвесь готовили методом прямого суспендирования из нескольких однотипных изолированных колоний стафилококков в стерильном физиологическом растворе и доводят до мутности 0,5 по МакФарланду (1,5х108 КОЕ/мл). Инокуляцию чашек с агаром проводили с помощью стерильного ватного тампона. Культуру наносили на ограниченную поверхность (диаметром 10 - 15 мм). Штаммы S. aureus инкубировали при температуре 350 С в течение полных 24 часов. Появление видимого роста после инкубации на месте нанесения культуры считали проявлением устойчивости данного штамма к оксациллину (метициллину). Исследование проводили при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера - Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуры наносили также как на агар с оксациллином). Параллельно с исследуемыми культурами тестировали также контрольные штаммы метициллинчув - ствительных и метициллинрезистентных стафилококков. Моноциты периферической крови получали стандартным методом адгезии к плоским поверхностям из мононуклеарных клеток, выделенных из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл - урографина (р=1,077) [8]. Функции фагоцитоза оценивали с помощью MRSA и MSSA меченых FITC. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлюориметре FC - 500 (Beckman Coulter, USA) [8, 9, 10] с использованием прямой иммунофлюоресценции цельной периферической крови с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, USA), меченных FITC (fluorescein isothiocyanate), PE или RD1 (phycoerythrin), PC5 (phycoerythrin - cyanin 5) и PC7 (phycoerythrin - cyanin 7) в следующей панели: FITC/CD14 - PE/ CD45 - PC7/CD16 - PC5 [11]. Исследование интенсивности «респираторного взрыва» моноцитов осуществляли через определение активности люцигенин - и люми - нол - зависимой спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. Индукцию моноцитов осуществляли живой бактериальной культурой MRSA/MSSA в концентрации 106 КОЕ/мл. Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 1 и 3 квартилей (Q25 и Q75). Достоверность различий между показателями зависимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона. Статистический анализ осуществляли в пакете программ Statistica 6.1 (StatSoft Inc., 2007). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Определение функциональной активности моноцитов у больных полипозным риносину - ситом включало в себя оценку кислородзави - симой системы фагоцитоза в виде определения хемилюминесцентной активности клеток и кис - лороднезависимого фагоцитоза. Хемилюминесцентное определение функциональной активности моноцитов базировалось на определении базовой активности моноцитов и резервных возможностей клеток при воздействии на них специфического индуктора в виде живой бактериальной суспензии MRSA относительно MSSA. Отдельно исследована способность моноцитов к образованию супероксидно - го аниона ( - О - 2) при активации люцигенином и образование общего пула свободных радикалов кислорода при активации люминолом [12]. Су - пероксидный анион - радикал образуется в результате ферментативных реакций и относиться к первичным радикалам кислорода являясь источником для вторичных радикалов (H2O2, OH, 1O2, HClO) выделяемых фагоцитами. При исследовании люминол - и люциге - нин - зависимой активности моноцитов в ответ на индукцию MRSA, было выявлено снижение интенсивности хемилюминесцентной реакции относительно спонтанной активности клеток в 3 раза, и повышение активности моноцитов относительно MSSA в 1,5 раза. 48 Р оссийский.^Аллергический ^Журнал Фагоцитарная активность моноцитов крови в ответ на метициллинрезистентные штаммы staphylococcus aureus у больных полипозным риносинуситом В результате исследования кислороднезави - симого фагоцитоза моноцитов в ответ на воздействие MRSA относительно MSSA было обнаружено снижение фагоцитарного числа общей популяции моноцитов в 2 раза. Оценка активности субпопуляционного состава моноцитов при воздействии штаммов MRSA относительно MSSA показала снижение фагоцитарного индекса субпопуляций CD14lowCD16+ - моноцитов и фагоцитарного числа CD14+CD16+ - клеток в 2 раза, а также фагоцитарного числа субпопуляций CD14+CD16 - - моноцитов в 2 раза. Таким образом при воздействии MRSA значительно изменяется хемилюминесцентная активность моноцитов периферической крови у больных полипозным риносинуситом. Обнаружено, что при индукции «респираторного взрыва» с помощью MRSA относительно MSSA активность НАДФН - оксидазы снижается. Ци - тотоксическая активность моноцитов определяется уровнем продукции как первичных, так и вторичных активных форм (гидроксильный радикал, перекись водорода и др.) кислорода. В люминол - зависимом процессе снижение интенсивности моноцитов крови при воздействии MRSA определяет пониженный уровень «респираторного взрыва», что в целом характеризует недостаточность цитотоксической активности моноцитов в ответ на воздействие золотистого стафилококка устойчивого к метициллину. Исследование показало, что у больных поли - позным риносинуситом в ответ на воздействие MRSA происходит снижение фагоцитарной активности относительно MSSA, при этом обнаружено, что фагоцитарное число значительно ниже, как в классических моноцитах с фенотипом CD14+CD16 -, так и в провоспалительных CD14+CD16+ - клетках. Можно отметить, что у больных полипозным риносинуситом при индукции MRSA установлены изменения в фенотипическом составе и интенсивности «респираторного взрыва» моноцитов периферической крови. Интенсивность «респираторного взрыва» в общей фракции моноцитов крови при индукции MRSA снижена. Можно предположить, что при индукции золотистым стафилококком функциональная активность моноцитов подавлена.