THE CHARACTER OF THE IMMUNE RESPONSE CHANGES IN PATIENTS WITH ALLERGIC BRONCHOPULMONARY ASPERGILLOSIS

Abstract

Full Text

Проведен сравнительный анализ иммунологических показателей у больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом (АБЛА) и бронхиальной астмой (БА). Выявлены сходные изменения иммунологических параметров у больных АБЛА и БА: снижение абсолютного и относительного количества NK-клеток, продукции интерферонов (ИФН-а и ИФН-у), повышение числа NKT-клеток. Особенностью иммунного реагирования больных АБЛА явилась повышенная продукция ИЛ-10 на фоне угнетения выработки ИФН-у в ответ на стимуляцию клеток крови аллергеном A. fumigatus. Таким образом, соотношение уровней исследованных цитокинов может служить прогностическим биомаркером течения заболевания и использоваться при мониторинге терапии АБЛА. АБЛА - заболевание легких, обусловленное гиперчувствительностью к Aspergillus spp., которое осложняет течение БА и муковисцидоза [1]. По оценкам экспертов, количество больных АБЛА в мире составляет около четырех миллионов человек, а в Российской Федерации порядка ста семидесяти пяти тысяч [2, 3]. Считают, что сенсибилизация к Aspergillus spp. у пациентов с БА играет существенную роль в поддержании хронического аллергического воспаления при АБЛА [4]. Однако количество публикаций по этой теме ограничено, а иммунопатогенез АБЛА изучен недостаточно. Цель исследования - изучение характера изменений иммунного ответа у больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом. Материалы и методы. В проспективное исследование включили две группы больных. Первую группу составили 11 больных АБЛА (Me - 38 лет), вторую группу - 15 больных тяжелой БА (Me - 45 лет). Для выявления микогенной сенсибилизации проводили кожное тестирование с грибковыми аллергеном Aspergillus («Allergopharma», Германия, разрешение этического комитета СЗГМУ им. И.И. Мечникова от 24.06.2014), в сыворотке крови методом ИФА определяли уровень общего иммуноглобулина Е (IgE) (ООО «Полигност», Россия) и специфических IgE (sIgE) к A. fumigatus («Алкор Био», Россия). Диагноз АБЛА устанавливали на основании критериев R. Agarwal et al., 2013 г. [5]. Контрольную группу составили 18 условно здоровых людей (Me - 37,5 лет). Имму-нофенотипирование лимфоцитов проводили с использованием проточного цитометра «FC-500» (Beckman Coulter, США). Лимфоциты окрашивали моноклональными антителами, меченными флуорохромами: CD45-FITC, CD4-RD1, CD8-ECD, CD3-PC5, CD19-ECD и CD56-RD1 (Beckman Coulter, США). Для исследования спонтанной продукции интерферона ИФН-у и ИФН-а использовали гепаринизированную кровь, разве 168 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Характер изменений иммунного ответа у больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом денную в 5 раз полной питательной средой: среда RPMI 1640 с добавлением L-глутамина («Биолот», Россия), 200 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, «Биолот», Россия). Для оценки индуцированной продукции интерферонов к клеткам крови добавляли ФГА («Sigma», США) в конечной дозе 50 мкг/мл или вирус болезни Ньюкасла (цитолитический титр 1/256, ФГУ НИИ гриппа, Россия). Время инкубации составило 24 часа. С целью изучения антиген-специфической продукции ИФН-у и интерлейкинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) к 100 мкл разведенной крови добавляли 100 мкл аллергена A. fumigatus («Алкор Био», Россия) в конечной концентрации 10 мкг/мл. В предварительных экспериментах были определены оптимальная доза аллергена и сроки культивирования клеток. Через 144 часа (6 суток) инкубации клеток надосадоч-ную жидкость аликвотировали и замораживали при -20 °C до проведения анализа. Цитокины в надосадочной жидкости определяли в коммерческих ИФА тест-системам («Вектор-Бест», Россия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Полученные данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 10. Для оценки различий между независимыми выборками применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Достоверными различиями сравниваемых параметров считали значения р < 0,05. Результаты и обсуждение. Микогенная сенсибилизация - важный этап в патогенезе АБЛА, поэтому положительная кожная проба и/или выявление sIgE к Aspergillus spp. в сыворотке крови > 0,35 МЕ/мл служат обязательными диагностическими критериями [1, 5]. В группе АБЛА в отличие от больных БА у всех больных установлена положительная кожная проба с аллергеном A. fumigatus и достоверно выше уровни общего IgE (963 (954 + 1691) vs 68 (10,0 + 600,0) МЕ/мл, р=0,0002) и sIgE к Aspergillus spp. (4,59 (0,48 + 13,1) vs 0,02 (0,01 + 0,02) МЕ/мл; р=0,0006). Иммунофенотипирование лимфоцитов у больных АБЛА и БА не выявило различий в относительном и абсолютном числе как Т-лимфо-цитов в целом (CD3+CD19-), так и основных их субпопуляций (CD3+CD4+, CD3+CD8+) по сравнению с условно здоровыми лицами. Не установ лено изменений в экспрессии маркера ранней активации на Т-хелперах (CD3+CD4+CD25+) в обеих группах обследованных больных. Особенностью больных БА по сравнению с контрольной группой было снижение абсолютного и относительного количества NK-клеток (CD3-56+) и повышение числа NKT-клеток (CD3+56+). В группе больных АБЛА снижение числа NK-клеток установлено в 72% случаев, а повышение количества NKT-клеток у 56% больных. Однако из-за большого разброса данных статистически значимых различий с условно здоровыми лицами не было выявлено. Известно, что NK-клетки являются ранними продуцентами ИФН-а и ИФН-у, участвующими в поляризации иммунного ответа по Т-хелперному 1 типу (Th1) [6, 7]. В нашем исследовании установлено ослабление способности клеток крови к продукции ИФН-а в обеих группах больных, достоверное снижение секреции ИФН-у у больных АБЛА и тенденция к снижению митоген-индуцированной продукции данного цитокина у больных БА. NKT-клетки рассматривают как неклассическую субпопуляцию Т-лим-фоцитов. Уровень тех или иных цитокинов, продуцируемых NKT-клетками, может изменяться в зависимости от вида презентируемого антигена [4]. Считают, что при развитии аллергического воспалительного процесса NKT-клетки поддерживают активацию ТЬ2, которые играют важную роль в патогенезе аллергических заболеваний. На следующем этапе исследования провели сравнительный анализ уровней патогенетически значимых цитокинов, продуцируемых клетками цельной крови в ответ на инкубацию с аллергеном A. fumigatus. Нами, как и другими исследователями, не установлена способность аллергенов A. fumigatus стимулировать клетки крови к продукции ИЛ-4 [7]. Предполагают, что это связано с тем, что ИЛ-4 в большей степени участвует в инициации иммунного ответа по ТЬ2 типу, в то время как ИЛ-13 и ИЛ-5 поддерживают дальнейшую поляризацию иммунного ответа [1]. В нашем исследовании поляризация специфического иммунного ответа оценивалась по способности клеток к продукции ИФН-у и ИЛ-10. Вычисляли индекс соотношения (ИС) индуцированной выработки ИФН-у/ИЛ-10. В контрольной группе грибковый аллерген активно стимулировал Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 169 Фролова Е.В., Козлова Я.И., Учеваткина А.В., Филиппова Л.В., Аак О.В., Соболев А.В., Климко Н.Н. лимфоциты к продукции ИФН-у и в меньшей степени к выработке ИЛ-10. ИС ИФН-у/ИЛ-10 был равен 5,6. Полученные нами данные совпадают с результатами других авторов, которые установили, что у здоровых людей чаще выявляют Aspergillus-специфичные клоны Т-лимфоцитов, вырабатывающие ИФН-у и редко секретирую-щие ИЛ-4, ИЛ-17 и ИЛ-10 [8]. Не установлено достоверных отличий между спонтанной и индуцированной грибковым аллергеном продукцией ИФН-у и ИЛ-10 у больных БА. Полученные данные могут свидетельствовать о выраженной активации клонов Т-лимфоцитов, специфичных к другим аэроаллергенам, но не к микромице-там. Это подтверждается отсутствием у больных БА sIgE к A. fumigatus. У больных АБЛА анти-ген-специфическая стимуляция выявила высокую продукцию клетками периферической крови ИЛ-10 (72,2 (44,8+108,2) vs 17,0 (8,0+45,0) пг/ мл; р=0,015) и тенденцию к снижению выработки ИФН-у (27,0 (16,4+59,0) vs 55,0 (40,0+55,0) пг/ мл, р=0,06) по сравнению с показателями условно здоровых людей, что отразилось в снижении ИС - 2,0. Данные цитокинового профиля больных АБЛА свидетельствуют об усилении активности специфических к A. fumigatus регуляторных Т-лимфоцитов, что характерно для включения механизмов ограничения воспалительного процесса. Однако, высокие урони sIgE к A. fumigatus указывают, что противовоспалительный цито-кин ИЛ-10 преимущественно подавляет продукцию ИФН-у и это способствует преобладанию Th2-rara иммунного ответа у больных АБЛА. Полученные данные согласуются с мнением, что именно сенсибилизация к Aspergillus spp. играет важную роль в иммунопатологических механизмах, лежащих в основе патогенеза АБЛА. Заключение. Выявлены сходные изменения иммунологических параметров у больных АБЛА и БА: снижение абсолютного и относительного количества NK-клеток, продукции ИФН-а и ИФН-у, повышение числа NKТ-клеток. Особенностью иммунного реагирования больных АБЛА явилась повышенная продукция ИЛ-10 на фоне угнетения выработки ИФН-у в ответ на стимуляцию клеток крови аллергеном A. fumigatus. Таким образом, соотношение уровней цитокинов может служить прогностическими биомаркерами течения заболевания и быть использованным при мониторинге терапии АБЛА.