THE RESEARCH OF SPECIFIC ACTIVITY OF ALLERGEN FROM HONEY BEE VENOM WITH USE OF ALGORITHM OF A STEP-BY-STEP ESTIMATION

Abstract

Full Text

Во врачебной практике чаще встречаются аллергические реакции на ужаление пчелой, осой, шершнем - насекомыми, относящимися к отряду перепончатокрылых (Hymenoptera). Аллергические реакции на ужаление характеризуются тяжестью симптомов, бурным течением и возможностью летального исхода [1]. Распространённость инсектной аллергии к перепончатокрылым насекомым в России составляет 0,4-8% [2]. Выраженные местные реакции на ужаления перепончатокрылых насекомых встречаются в 2,4-26,4% общей популяции населения. Системные реакции выявлены у 0,5-3,3% I обследованных жителей в США. Среди взрослого населения Eвропы сенсибилизацию к жалящим насекомым выявляют в 9,2-28,7% случаев, а превалирование системных реакций колеблется от 0,3 до 7,5% [3, 4]. В России системные реакции отмечены у 6,4% обследованных пациентов на гиперчувствительность к ужалению перепончатокрылыми насекомыми [5]. Смертность от анафилактических реакций на яд жалящих насекомых составляет 0,03-0,48% случая на миллион населения ежегодно [6]. К группе риска относятся пчеловоды, так как у 1543% возникает аллергия к яду пчёл. Атопические Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 155 Федоскова Т.Г., Федосеева В.Н., Мартынов А.И., Шабанов Д.В., Миславский О.В., Маковецкая А.К. заболевания зарегистрированы у 31-35% больных аллергией к ужалению перепончатокрылым насекомым [1]. Следует обратить внимание, что проведение специфической аллергодиагностики у пациентов с аллергией к ужалению перепончатокрылыми насекомыми с использованием метода кожного тестирования, может привести к обострению аллергического заболевания, вплоть до провокации реакций анафилактического типа. Из этого следует необходимость применения лабораторных тестов позволяющих исключить контакт пациента с инсектным аллергеном. Существующая система клиноко-лабораторной диагностики инсектой аллергии (анализ анамнеза болезни, оценка специфических IgE) не охватывает все механизмы реакций гиперчувствительности к жалящим насекомым. В этом случае постановка тестов с использованием клеток-мишеней аллергических реакций позволит выявить наличие сенсибилизации у пациента к конкретному насекомому и обеспечит прогнозирование развития у пациента анафилактического шока. Разработанный в институте иммунологи алгоритм представляет собой последовательность методических исследований для изучения специфической активности инсектных аллергенов в системе «in vitro» на модели клеток-мишеней аллергических реакций. Алгоритм включает следующие методические исследования: 1) Определение специфических IgE-антител в сыворотках крови пациентов к инсектным аллергенам. 2) Определение уровня выделения гистамина при воздействии инсектными аллергенами на клетки-мишени (базофилы). В работе нами было показано необходимость использования контроля на специфическое IgE связывания с высокоа-финным Fc рецептором базофилов. 3) Клеточный аллерген, стимуляционный тест для количественного определения уровня выделения сульфидолейкотриенов из базофилов [7]. 4) Базофильный активационный тест для определения процента активированных базофи-лов на поверхности, которых появляется маркер CD63 [8]. 5) Тест «для диагностики in vitro» для обнаружения активированных базофилов. Этот тест позволяет чётко гейтировать базофи-лы в образцах цельной крови по фенотипу (CRTH2posCD203cposCD3neg) [9]. Использование, указанных в алгоритме методов оценки специфической активности ин-сектных аллергенов обеспечило проведение исследований в соответствии со спецификой патофизиологических процессов, определяющих аллергореактивность суммарной аллергенной фракции (САФ) из яда пчелы медоносной - препарата отечественной разработки [10]. Провели исследование 175 сывороток больных различными атопическими заболеваниями, имеющими в анамнезе гиперчувствительность на ужаления пчёлами (диагнозы устанавливались на основании данных сбора анамнеза и общепринятых методов аллергологического обследования в клинике ГНЦ-Института Иммунологии ФМБА России). При этом было выявлено 26 пациентов с высокими показателями специфических IgE, сыворотки которых составили основной диагностический банк сывороток. Общий IgE в интервале 400-800 МЕ/мл (3-4 класс ИФА). У 14 пациентов с гиперчувствительностью на ужаления пчёлами (3 класс ИФА) уровень гистаминолиберации составил 38,7% ± 4,7 при постановке теста с аллергеном из яда пчелы (АЯП), в тесте использованием специфического контроля - 45,4% ± 5,2 (антитела против IgE-связывающего FcsR1 рецептора базо-филов). При исследовании проб от 12 пациентов с гиперчувствительностью на ужаления пчелами (4 класс) уровень гистаминолиберации составил 52,6% ± 5,4 при использовании АЯП, при использовании специфического контроля - 58,4% ± 4,9. Отрицательным считали результат, когда уровень гистаминолиберации был менее 10%. Для 14 пациентов с гиперчувствительностью на ужа-ления пчёлами (3 класс) уровень сульфидолейкотриенов (sLT) в супернатанте лейкоцитарной взвеси составил 539,8 пг/мл ± 24,7 при использовании аллергена яда пчелы, при использовании специфического контроля - 585,4 пг/мл ± 28,2. При исследовании проб от 12 пациентов с гиперчувствительностью на ужаления пчелами (4 класс) уровень sLT составил 665,6 пг/мл ± 29,5 при использовании аллергена яда пчелы, при использовании специфического контроля - 694,8 пг/мл ± 34,7. У 14 пациентов с гиперчувствитель 156 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Исследование специфической активности аллергена из яда пчелы медоносной с использованием алгоритма пошаговой оценки ностью на ужаления пчелами (3 класс) уровень активации базофилов по маркеру CD 63+ составил 42,7% ± 5,8 при использовании аллергена яда пчелы, при использовании специфического контроля - 47,4% ± 4,8. При исследовании проб от 12 пациентов с гиперчувствительностью на ужале-ния пчелами (4 класс) уровень активации базо-филов по маркеру CD 63+ составил 55,6% ± 4,7 при использовании аллергена яда пчелы, при использовании специфического контроля - 59,4% ± 5,1. Для 14 пациентов с гиперчувствительностью на ужаления пчелами (3 класс) уровень активации базофилов по маркеру CD 203+ составил 53,7% ± 6,1 при использовании аллергена яда пчелы, при использовании положительного контроля - 69,4% ± 5,8. При исследовании проб от 12 пациентов с гиперчувствительностью на ужале-ния пчелами (4 класс) уровень активации базо-филов по маркеру CD 203+ составил 63,7% ± 6,5 при использовании аллергена яда пчелы, при использовании положительного контроля - 75,4% ± 5,6. Показатели активации клеток-мишеней выше 10 % ± 1,2 свидетельствовали о позитивном результате при оценке специфической активности САФ полученной из яда пчелы медоносной. За 100% брали общее количество базофилов в пробе (600 клеток) при измерении на проточном цитометре. Разработан алгоритм для пошаговой оценки специфической активности инсектных аллергенов с использованием маркеров активации (CD63, CD203) клеток-мишеней аллергических реакций (базофилов), количественного определения медиаторов аллергических реакций (гистамина, сульфидолейкотриенов) и IgE-спец-ифическекого критерия в системе «in vitro». Использование данного алгоритма в клинической лабораторной диагностики позволит прогнозировать интенсивность формирования аллергических реакций, выявлять состояние «готовности» клеток-мишеней (базофилов) к дегрануляции и медиаторному ответу на специфический аллерген. Проведенное изучение специфической активности инсектных аллергенов в системе «in vitro» на модели клеток-мишеней аллергических реакций, с использованием представленного в нашей работе алгоритма исследования, показало специфическую активность полученного аллергена из яда пчелы.