THE CONTENT IN MONONUCLEAR LEUKOCYTES OF PERIPHERAL BLOOD OF TRANSCRIPTION FACTORS AND THE LEVEL OF PHOSPHORYLATION OF THE TERMINAL COMPONENTS OF THE MAPK/SAPK-SIGNALING PATHWAY AT THE CONVALESCENT COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA

Abstract

Full Text

Эффективность восстановления организма после перенесённых инфекционных заболеваний в значительной степени определяется завершённостью их постклинических стадий и восстановлением нормальных межклеточных взаимодействий, а так же молекулярных процессов в иммунокомпетентных клетках, включая процессы транскрипции генов провоспа-лительных цитокинов, молекул межклеточных взаимодействий, белков ответа острой фазы и т.п. [1]. Из числа факторов, контролирующих процессы, лежащие в основе саногенеза, важную роль играют транскрипционные факторы АР-1, NF-AT, T-box, FOXP3, NF-kB и др. [2]. В регуляции ответа острой фазы, а также пролиферации и дифференцировки клеток важную роль играет также митоген-стимулируемый и стресс-акти-вируемый (MAPK/SAPK) сигнальный путь [3, 4]. Показано, в постклиническом периоде внеболь-ничной пневмонии имеет место дизрегуляция продукции про- и противовоспалительных цито-кинов, депрессия фагоцитарной активности мо-нонуклеарных клеток цельной крови, повышение активности внутриклеточных сигнальных путей, способствующих затяжному течению заболева ния и снижению резистентности организма [5, 6]. Указанные изменения, очевидно, определяются дисбалансом активности транскрипционных факторов и дизрегуляции сигнальных путей в соответствующих клетках. Учитывая недостаточно полное исследование вопроса о содержании в иммунокомпетентных клетках реконвалесцентов внебольничной пневмонии, целью настоящего исследования являлось изучение уровня факторов транскрипции NF-AT, AP-1, T-box, FOXP3, NF-IL6, YB1, E2F4, GATA3, протеинкиназ ERK и p38 в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови (МНК). Материалом исследования служила венозная кровь практически здоровых лиц (n=30), составивших группу контроля, и лиц с внебольнич-ной бактериальной пневмонией (ВП) нетяжёлого течения (n=30) в возрасте 20-35 лет (средний возраст 22,5±2,5 года) на 17-21 сутки заболевания (перед выпиской из стационара). Выделение МНК и подготовка ядерно-цитоплазматических лизатов осуществлялись в соответствии с рекомендациями производителя наборов реагентов для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), для чего использовали 1 мл клеточной су- Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 149 Терехов И.В. спензии содержащей 5х106 клеток. Подсчёт клеток и анализ их жизнеспособности осуществляли с помощью счётчика TC20 (Bio-Rad, США). Жизнеспособность клеток составляла более 90%. В соответствии с поставленной целью, в лизате МНК, методом ИФА определяли содержание (концентрацию - нг/мл) факторов транскрипции NF-AT, AP-1, T-box, FOXP3, NF-IL6, YB1, E2F4, GATA3, а также уровень фосфорилирования (в условных единицах на нг белка - ед/нг) терминальных протеинкиназ МАРК/SAPK-сигнального пути - р38, ERK (1 и 2 изоформ). При проведении исследования использовали наборы реактивов производства CUSABIO BIOTECH (Китай). Анализ проводили на анализаторе Personal LAB (Adaltis Italia S.p.A., Италия). Статистическую обработку проводили в программе STATISTICA 7,0. В процессе исследования рассчитывалось среднее значение, медиана (Ме) исследуемого показателя, а также 25 и 75 процен-тили выборки (25%; 75%). Статистическую значимость (р) межгрупповых различий оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Результаты исследования представлены в следующем виде: среднее значение (25%; Me; 75%). Результаты исследования и их обсуждение. Проведенный анализ показал, что содержание в МНК фактора транскрипции FOXP3 в группе контроля составило 10,1 (9,74; 10,2; 10,5) нг/мл, в основной группе - 11,0 (10,4; 10,9; 11,5) нг/мл. Содержание GATA3 у практически здоровых лиц составило 0,15 (0,08; 0,1; 0,23) нг/мл, у реконва-лесцентов ВП - 0,36 (0,14; 0,2; 0,48) нг/мл. Уровень T-box в группе контроля составил 1,28 (1,2; 1,31; 1.37) нг/мл, в основной группе - 1,24 (1,16; 1,33; 1.37) нг/мл. Содержание NF-AT в контрольной группе составило 0,18 (0,16; 0,16; 0,19), в основной - 0,4 (0,18; 0,4; 0,61) нг/мл. Уровень транскрипционных факторов контролирующих инфекционно-воспалительный ответ, в частности, NF-IL6, в контрольной группе составил 0,47 (0,15; 0,23; 0,79) нг/мл, в основной - 0,39 (0,21; 0,26; 0,38) нг/мл. При этом содержание АР-1 в контрольной группе составило 0,16 (0,14; 0,17; 0,17) нг/мл, в основной - 0,28 (0,19; 0,23; 0,36) нг/ мл. Также установлено, что уровень транскрипционного фактора E2F4 в группе контроля составил 0,71 (0,65; 0,67; 0,77) нг/мл, тогда как в основной группе - 0,46 (0,35; 0,45; 0,58) нг/мл. При этом концентрация фактора YB1 в группе контроля составила 0,39 (0,35; 0,39; 0,42) нг/мл, в основной группе - 0,48 (0,41; 0,44; 0,51) нг/мл. На этом фоне уровень фосфорилирования протеинкиназы р38 в группе контроля составил 0,43 (0,31; 0,44; 0,57) ед/нг, а в основной группе - 0,66 (0,29; 0,36; 0,86) ед/нг, при содержании в МНК протеинкиназы ERK - 2,38 (1,98; 2,14; 2,82) и 2,17 (1,63; 2,11; 2,8) ед/нг соответственно. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что реконвалесценция ВП протекает на фоне повышенного на 136,6% (р = 0,0005) содержания в МНК фактора транскрипции GATA3, на 128,6% - NF-AT (p < 0,0001), на 77,4% - AP-1 (p < 0,0001), на 23,4% - YB1 (р = 0,0002), на 9,0% - FOXP3 (p < 0,0001). Также у ре-конвалесцентов ВП имело место снижение содержания в МНК ядерного фактора транскрипции E2F4 на 20,7% (p < 0,0001), NF-IL6 на 16,0% (р = 0,33), T-box на 3,3% (р = 0,46) от соответствующего уровня практически здоровых лиц. На этом фоне уровень фосфорилированной формы протеинкиназы р38 у реконвалесцентов ВП, в сравнении с практически здоровыми лицами, был повышен на 51,8% (р = 0,02), при сниженном на 8,7% (р=0,19) уровне ERK. Полученные результаты позволяют говорить о том, что постклиническая фаза инфекционно-воспалительного процесса у пациентов с ВП отличается сохранением активационных стимулов, способствующих поддержанию активности иммунокомпетентных клеток, в частности, Т-ре-гуляторных клеток и Т-хелперов 2-го типа. Кроме того, повышенный уровень фосфорилированной формы протеинкиназы р38, в сочетании с повышенным уровнем фактора транскрипции АР-1, позволяет говорить о незавершённом воспалительном ответе иммунокомпетентных клеток ми-елоидного ряда, в частности, моноцитов и макрофагов. Сниженный уровень фактора транскрипции E2F4, терминальной протеинкиназы ERK, наряду с повышенным уровнем фактора YB1 позволяет говорить о дизрегуляции клеточной пролиферации и дифференцировки в данную фазу патологического процесса. Указанное обстоятельство требует более тщательной клинической оценки состояния реконвалесцентов ВП и акцента при осуществлении реабилитационных мероприятий на иммунореабилитации с применением немедикаментозных методов лечения [7, 8]. 150 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Полиморфизм ToLL-подобный клеточных рецепторов TLR2 и TLR4 и уровень цитокинов у больных атопическим дерматитом