SERUM ALBUMIN IN REGULATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF INTERFERONS

Abstract

Full Text

Сывороточный альбумин (СА) - сложная, полифункциональная система, выполняющая коммуникативные функции в живых системах. Уникальная конформационная подвижность молекулы СА, его полифункциональность и участие в поддержании ряда важнейших составляющих гомеостаза в многоклеточном организме -всё это делают альбумин объектом пристального изучения для решения актуальных задач фундаментальной и прикладной биомедицины [1, 2]. СА оказывает существенное влияние на окислительно-восстановительный потенциал организма, обладая про- и антиоксидантными свойствами, формируя своеобразную «буферную» систему, а также участвует в тиоловом обмене [8]. Важнейшей функцией СА является участие молекулы в транспорте самого широкого спек тра соединений эндо- и экзогенного происхождения, причём показана уникальная способность СА обеспечивать трансэндотелиальный переход в системе «кровь-ГГБ (ГЭБ)», а также связанная с транспортом веществ дезинтоксикационная функция белка [3, 5, 7]. В последнее время особое внимание исследователей привлекают представители новой функциональной группы эндогенных веществ - аларминов, или ДАМП, появляющихся при повреждении различного характера и определяющих запуск сложных процессов, направленных на восстановление гомеостаза [4, 6]. К числу данных молекул относят и интерферон-альфа (ИФН-a), обладающего выраженной противовирусной, антипролиферативной и регуляторной активностями. Функциональная активность 124 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Сывороточный альбумин в регуляции функциональной активности интерферонов аларминов зависит от разных факторов: как от типа деструктивного процесса, силы и выраженности патогенетического фактора, от характера их химической модификации (окислительные модификации, протеолиз и др.), так и от скорости высвобождения и распределения этих соединений во внутренней среде организма. Определенную роль может иметь неспецифическое взаимодействие с другими белками, в частности, с молекулами СА. В связи с выше изложенным, целью данной работы являлось исследование влияния СА на концентрацию ИФН-а при различных условиях (рН среды и температуре) и сроках инкубации, что может отражать вероятное влияние СА на функциональную активность данной группы ци-токинов. Постановка эксперимента: 1) Приготовление рабочего раствора сывороточного альбумина проводили путём разведения исходного 100 г/л раствора САЧ (производства ФГУП «НПО Микроген», Россия) соответствующим буфером - ацетатном буфере, рН 3.4; фосфатном буфере, рН 7,4 и ТРИС-HCI буфере, рН 8.4 в соотношении 1:1 (1 часть 100 г/л САЧ и 1 часть буфера); 2) приготовление рабочего раствора ИФН-а: содержимое ампул с леофилизированным лейкоцитарным препаратом интерферона-альфа (производства ФГУП «НПО Микроген», Россия) разводили в 2 мл соответствующего буфера (ацетатном буфере, рН 3.4; фосфатном буфере, рН 7.4 и ТРИС-HCI буфере, рН 8.4). Рабочие растворы САЧ и ИФН-а прединку-бировали при температуре 18±2,00С в течение 30 минут. По истечении времени прединкубации готовили основную инкубационную смесь, включающую 1 мл рабочего раствора САЧ (50 г/л) и 50 мкл ИФН-а. 3) Экспериментальная модельная система содержала 1 мл САЧ (50 г/л) и 50 мкл ИФН-а на соответствующем буфере. Модельные системы разделяли по сериям (10 параллелей в каждой), которые инкубировали при 370С и 500С в течение 15 и 30 минут. По завершению сроков инкубации в инкубационной смеси проводили определение концентрации ИФН-а методом твердофазного им-муноферментного анализа с использованием коммерческого набора «Альфа-интерферон-И-ФА-Бест» производства ЗАО Вектор-Бест (Ново сибирск, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Результаты считывали на фотометре Stat Fax 2100 (Awareness Technology, Inc., USA), с использованием программного обеспечения для иммуноферментного анализа PlateStat (Austria). Концентрацию ИФН-а в инкубационной системе рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в пг/мл. Результаты, полученные в сериях опытов, обрабатывали статистически по методу Стьюден-та-Фишера. Функциональная активность биологически важных молекул, к которым относятся как молекулы интерферона, так и молекулы альбумина, зависит от особенностей структурной организации, определяемой условиями, в которых находится молекула. При изменении условий (рН, температура) происходит закономерное изменение пространственной организации биополимеров с дальнейшим изменением их функциональной активности. При этом следует отметить возможность взаимодействия полипептидов, что также вносит свой вклад в характер реализации функциональной активности молекул. Проведение совместной инкубации САЧ и ИФН-альфа при различных значениях рН и температурах приводит к выраженным изменениям концентрации ИФН-альфа, а характер выявленных изменений позволяет говорить о некоторых особенностях вероятного взаимодействия САЧ и ИФН-альфа. Так, при рН 3,4, температуре 370С и 500С концентрация ИФН-альфа после инкубации с САЧ составила 20,2±0,8 пг/мл (15 мин), что ниже контрольных данных на 79% (р<0,05), 18,2±0,8 пг/мл (30 мин), что выше контрольных данных на 275% (р<0,05) и 14,6±2,2 пг/мл (15 мин), что ниже контрольных значений на 79% (р<0,05), 3,0±0,6 пг/ мл (30 мин), что ниже контрольных значений на 57% (р<0,05) соответственно. При рН 7.4, температуре 370С и 500С концентрация ИНФ-альфа после инкубации с САЧ, составила 120,9±6,4 пг/мл (15 мин), что выше контрольных данных на 10% (р<0,05), 124,6±4,1 пг/ мл (30 мин), что выше контрольных данных на 26% (р<0,05) и 121,2±8 пг/мл (15 мин), что выше контрольных значений на 13% (р<0,05), 126,3±5,9 пг/мл (30 мин), что выше контрольных значений на 51% (р<0,05) соответственно. При рН 8.4, температуре 370С и 500С концентрация ИНФ-альфа после инкубации с САЧ, со Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 125 Сагакянц А.Б. ставила 114,3±6.1 пг/мл (15 мин), что выше контрольных данных на 15% (р<0,05), 62,7±5.3 пг/ мл (30 мин), что выше контрольных данных на 10% (р<0,05) и 107,9±2,4 пг/мл (15 мин), что выше контрольных значений на 34% (р<0,05), 63.5±3.4 пг/мл (30 мин), что выше контрольных значений на 51% (р<0,05) соответственно. Увеличение концентрации ИФН-альфа может свидетельствовать о вероятном взаимодействии молекул данного цитокина с молекулами СА. Вероятно, основой для взаимодействия данных белков является изменение пространственной структуры альбумина, особенно выраженные при низких значениях рН, где наблюдается N-F конформационный переход с расширением молекулы белка, расхождением в пространстве доменов, что способствует, вероятно, увеличению способности альбумина присоединять различные лиганды. На фоне структурных преобразований отмечается мономеризация молекул ИФН-альфа, что также может обуславливать повышение вероятности его присоединения к альбумину. В данных условиях роль подобного взаимодействия может заключаться в стабилизации пространственной структуры ИНФ-альфа, что, несомненно, будет благоприятно сказываться на функциональной активности белка. Особенности организации, обмена в организме и распределения, а также за счёт взаимодействия с рядом рецепторов, молекула СА характеризуется длительным периодом полужизни в циркуляторном русле - около 19 дней [5, 7]. Все процессы перераспределения в организме СА опосредуются несколькими рецепторами: gp18, gp30, gp60, кубулин (cubulin), мегалин (megalin) и неонатальный Fc рецептор (FcRn). Показано участие данных рецепторов в обеспечении функциональной активности СА и присоединенных к молекуле веществ. В нашей лаборатории было проделано дополнительное исследование возможной модулирующей активности СА по отношению к функциональным свойствам ИФН-а2, в частности, на способность последней индуцировать продукцию ряда цитокинов (ЦК) клетками периферической крови доноров в опытах ex vivo. В результате отмечено, что интенсивность спонтанной и митоген-активируемой продукции ЦК клетками периферической крови зависит от наличия в инкубационной среде ИФН-а2, либо прединкуби-рованного комплекса «СА-ИФН-а2», в последнем случае отмечено более выраженное изменение продукции ЦК. Наиболее выраженное изменение коэффициента стимуляции клеток крови по продукции ЦК наблюдается в том случае, когда комплекс «СА-ИФН-а2» прединкубировался в ацетатном буфере, рН 3,4. На основании проведённых экспериментов и литературных данных можно предположить, что при развитии патологических процессов, сопровождающихся ацидозом интерстиций, формируются условия, обеспечивающие эффективное взаимодействие не только СА и FcRn, но и СА и ИФН-а2. Данный тип взаимодействий может определять функциональную активность реагирующих молекул, особенности которой требуют дальнейшего исследования.