REPERTOIRES OF ANTI-GLYCAN ANTIBODIES IN NORMAL AND COMPLICATED PREGNANCY

Full Text

Одним из механизмов, которые обеспечивают формирование толерантности иммунной системы матери к фетальным аллоантигенам при беременности, является развитие противовоспалительного гуморального Th2-им-мунного ответа, протективного в отношении плода [1]. Так, при беременности показана продукция протективных «блокирующих» антител, защищающих фетальные клетки от иммунного надзора материнской иммунной системы [2, 3] . Также есть множество сообщений, что при патологии беременности наблюдается повышенный синтез антител, участвующих в иммунопатологических реакциях [4, 5]. Все проводимые на сегодняшний день исследования гуморального иммунитета при беременности не учитывают исходно присутствующие в организме естественные антитела, которые выполняют регуляторную функцию в организме [6]. Известно, что значительное число естественных антител направлено к гликанам клетки и вне клеточного матрикса [7], что при беременности может оказывать существенное влияние на межклеточные контакты и плацентацию, т.к. гликаны являются ключевыми молекулами в этих процессах [8]. Известно, что нарушённые межклеточные контакты при формировании плаценты являются основным патогенетическим фактором развития преэклампсии (ПЭ) - одного из наиболее тяжёлых осложнений беременности, характеризующееся гиперактивацией иммунной системы, которое является одной из основных причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности во всем мире [9]. В этой связи, характеристика анти-гликановых антител (АгАТ) при ПЭ является приоритетной темой данного исследования. Наши исследования сфокусированы на антигликановых (IgG) антителах, поскольку антитела G класса являются наиболее распространёнными и стабильными молекулами в сыворотке крови и составляют основу защитного иммунитета [10]. Изучение профиля АгАТ Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 49 Зиганшина М.М., Шилова Н.В., Хасбиуллина Н.Р, Ракитько А.С., Кан Н.Е., Тютюнник В.Л., Тютюнник Н.В., Мантрова Д.А., Бовин Н.В., Сухих Г.Т. проводили с помощью гликанового микрочипа (гликочипа), лигандами которого являются природные и синтетические гликаны, входящие в состав большинства гликопротеинов и гликолипидов человека, в том числе антигенам групп крови AB0, Lewis и т.д. и их производным [11]. Материал и методы В одномоментное исследование были включены 66 пациентов. Основную группу составили 26 пациенток с ПЭ (группа 1), группу сравнения составили 30 здоровых беременных (группа 2), и 10 условно здоровых небеременных женщин (группа 3). Критерии включения: для групп 1 и 2: одноплодная беременность, наступившая в естественном цикле, третий триместр беременности; для группы 1: беременность, осложненная ПЭ; для группы 3: 19-24 дни менструального цикла, отсутствие приема комплексных оральных контрацептивов. Критерии исключения: тяжелая акушерская и экстрагенитальная патология, острые воспалительные и аутоиммунные заболевания, гемотрансфузии и трансплантации органов в анамнезе, применение препаратов человеческих иммуноглобулинов, и препаратов, влияющих на выработку и биодоступность антител. Для определения АгАТ в периферической крови использовали микрочипы, содержащие 374 гликана, (ООО «Семиотик», Россия). Чипы инкубировали с исследуемыми сыворотками как описано в [11], после чего связавшиеся с глика-нами антитела проявляли вторичными антителами против IgG флуоресцентно мечеными Alexa555 (Invitrogen, США). Сигналы считывали с помощью флуоресцентного сканера ScanArray Gx (Perkin Elmer, США). Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ScanArrayExpress 4.0, используя метод фиксированных колец диаметром 70 мкм. Значимыми считались величины флуоресценции, превышающие фоновое значение (т.е. величину сигнала от поверхности, не содержащей лиганд) в 5 раз. Уровень АгАТ (отражающий аффинность антител и их количество) характеризовали с помощью медианы интенсивностей флуоресценции повторов лигандов гликочипа. Статистическая обработка полученных данных производилась с помощью электронных таблиц Microsoft Office Excel и программного обе спечения R (разработчик - The R Foundation for Statistical Computing). Процедура контроля качества была выполнена перед обработкой данных, как описано в [12]. Полученные массивы данных были исследованы с помощью непараметрического теста Крускала-Валлиса; для установления межгрупповых различий были использованы попарный тест Крамера и непараметрический тест Вилкоксона-Манна-Уитни (WMW-тест). В данном исследовании была применена поправка на множественность [13], с учётом которой рассматривались значения при р<0,00075. Данные представлены как средняя величина сигналов интенсивности флуоресценции (среднее ± ошибка среднего). Результаты и обсуждение 1. Характеристика профилей антител в рассматриваемых группах По результатам тестов на контроль качества данных из 374 были отобраны 134 АгАТ. Анализ распределения сигналов в рассматриваемых группах показал, что профили антител больных с ПЭ (группа 1), в целом, занимают промежуточное положение, отличное от здоровых беременных и условно здоровых вне беременности. Средняя величина сигналов интенсивности флуоресценции имеет максимальные значения у здоровых вне беременности (группа 3), и минимальные значения - у здоровых беременных (группа 2). 2. Межгрупповое сравнение спектров антиг-ликановых антител А. Различия в спектрах антигликановых антител в рассматриваемых группах Максимальные отличия в спектрах анти-гли-кановых антител наблюдаются при попарном сравнении групп 2 и 3 (WMW-тест). Значимые отличия выявлены по АгАТ к изолактозамину -дисахариду LeC (Galß1-3GlcNAcß) и ряду его 3’-замещенных производных, а также по антителам к дисиаловой кислоте (Neu5Aca2-8Neu5Aca2). Попарный WMW-тест выявил значимое отличие между группами 1 и 2 по антителам к сульфатированному ди^-ацетиллактозамину GalNAcß1-4(6-O-Su)GlcNAcß-sp (р <0,000479); однако между группами 1 и 3 значимых отличий обнаружено не было (с учетом поправки на множественность). Согласно тройному тесту Крускала-Валлиса 50 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Репертуары анти-гликановых антител при физиологической и осложненной беременности достоверные отличия между всеми тремя группами были выявлены только по АгАТ к сульфати-рованному ди-Ы-ацетиллактозамину GalNAcß1-4(6-O-Su)GlcNAcß-sp (р=0,00009). Б. Сходство в спектрах антигликановых антител в рассматриваемых группах Если смотреть на относительное отклонение средних в группах, то можно выделить гликаны, по сигналам антител к которым все группы демонстрируют сходство. Это антитела к мальтолигоса-харидам (Glca1-4Glcß-; (Glca1-6)4ß-; (Glca1-6)5ß-), N-ацетиллактозамину-а (Galß1-4GlcNAca-) и бензильному производному a-N-ацетиллактоза-мина (6-Bn-Gala1-4(6-Bn)GlcNAcß-). Проведенные нами исследования спектров АгАТ-IgG у здоровых доноров, а также у пациенток с физиологической и осложненной ПЭ беременностью показал, что, во-первых, при физиологической беременности выявлен системный эффект уменьшения общего уровня АгАТ-IgG: пациентки с ПЭ по уровню АгАТ-IgG, занимают промежуточное положение между здоровыми беременными и небеременными донорами. Во-вторых, различия между группами наиболее ярко выражены у здоровых небеременных доноров и пациенток с физиологической беременностью. Лидерами в этом сравнении являются антитела к LeC и его аналогам. Сигналы анти-LeC-IgG значимо ниже при беременности, что может быть свидетельством их возможной роли в формировании толерантности к плоду в качестве «блокирующих антител». В-третьих, различия между всеми тремя группами выявлены по АгАТ-IgG против сульфатированного ди^-ацетиллакто-замина (GalNAcß1-4(6-O-Su)GlcNAcß-), что, возможно, демонстрирует потенциальную роль этих антител в формировании иммунологической толерантности при беременности, и патогенезе ПЭ. В-четвертых, выявлены АгАТ-IgG (антитела против GlcNAa-терминированных гликанов, гликанов с коровой лактозой и мальтоолигосаха-ридов), уровень которых остаётся неизменным у всех трех групп, что может указывать на их принадлежность к естественным антителам, а также на избирательность изменения антител при беременности, и, вероятно, регуляторную роль АгАТ IgG.

About the authors

M M Ziganshina

Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

N V Shilova

M.M. Shemyakin and Y.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

N R Khasbiullina

M.M. Shemyakin and Y.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

A S Rakitko

M.V. Lomonosov Moscow State University

Department of Mechanics and Mathematics

N E Kan

Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

V L Tyutyunnik

Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

N V Tyutyunnik

Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

D A Mantrova

Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

N V Bovin

M.M. Shemyakin and Y.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

G T Sukhikh

Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files