IMMUNOSTIMULATORY ACTIVITY OF COPOLYMER N-VINYLPYRROLIDONE AND N-2-METHYL- 5-VINYLPYRIDINE AGAINST THE RABBIT VIRAL HEMORRHAGIC

Abstract

Full Text

Вспышки вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК) регулярно регистрируются по всему миру [1]. Эпизоотология ВГБК характеризуется высокой контагиозностью и 80100% летальностью, при этом болезнь в основном протекает в острой и сверхострой форме, без проявления клинических признаков до начала агонального периода [2]. Трудности в диагностике данного заболевания и отсутствие препаратов, способных эффективно бороться с возбудителем у заражённого животного, делают вопросы профилактики ВГБК особенно актуальными для животноводства. Основными методами предупреждения распространения ВГБК является массовая вакцинация животных [3, 4]. Однако известные к настоящему времени вакцины не позволяют сохранить 100% популяции животных в случае вспышки инфекции на животноводческом предприятии. Кроме того, эффективность существующих вакцин снижается вследствие изменения популяционной структуры вируса, что обусловливает необходимость поиска новых вакцин и способов повышения их активности. В ходе проведённых исследований была изучена возможность повышения эффективности инактивированной вакцины путём комбинированного введения её с сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина, иммуно-адювантное действие которого показано ранее [5, 6, 7], определены оптимальные дозы сополимера и вакцины для формирования надежного иммунитета у животных против вирусной геморрагической болезни кроликов. Материалы и методы исследований Для приведения исследований использовали: сухую инактивированную вакцину против вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК), производства ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; сополимер N-винилпирролидона и 2-ме-тил-5-винилпиридина, полученный радикальной сополимеризацией при поддержании постоянства мономерного состава реакционной массы и очищенный методом ультрофильтрации [7, 8, 9]. В качестве основного объекта исследования был выбран водорастворимый образец сополимера [10] c содержанием звеньев 2-метил-5-винилпи-ридина 35 мол.% и средневискозиметрической Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 39 Еремин Д.В., Панов А.В., Кочкина Ю.В., Селянинов Ю.О., Зубаиров М.М., Кедик С.А. молекулярной массой 27 кДа; Вирулентный вирус ГБК штамм «В-87», инфекционная активность не менее 103,0 ЛД50/см3 или активность в РГА 1/256 и выше. В качестве подопытных животных использовались кролики породы «шиншилла» массой 3,0 ± 0,5 кг в количестве 28 голов. Предварительно у 10% кроликов брали кровь и сыворотку для определения реакции задержки гемагглютинации (РЗГА) на наличие антител к возбудителю ВГБК. Для оценки влияния сополимера на сроки формирования защиты (иммунитета) при заражении вирусной геморрагической болезнью кроликов содержимое 10 ампул (флаконов) с вакциной растворяли в стерильной дистиллированной воде или физиологическом растворе в количестве, равном количеству до лиофилизации. Готовили 6 групп кроликов по 4 головы в каждой и 4 головы использовали для контроля вирулентности вируса. Препарат и вакцину вводили однократно внутримышечно в область внутренней стороны бедра кролика в объеме 0,5 см3. Схема введения для 1 и 2 группы кроликов включала только вакцину в разведении 1:50 и 1:100 соответственно. Разведённая 1:50 вакцина для 3 и 4 группы кроликов содержала 50 и 150 мкг/кг сополимера соответственно. Препарат, вводимый 5 и 6 группе кроликов, содержал 50 и 150 мкг/кг сополимера соответственно при разведении вакцины 1:100. Контрольную группу из 4 кроликов оставляли не привитыми и содержали отдельно. На 7, 14 и 21 сутки у кроликов 1 - 6 групп брали пробы крови и в сыворотках определяли наличие специфических к вирусу ВГБК антител в РЗГА. Через 21 день после иммунизации животных всех групп заражали внутримышечно в область внутренней поверхности бедра по 1,0 см3 вирулентным вирусом ГБК в дозе 1000 ЛД50. Для постановки реакции гемагглютинации (РГА) готовили общую пробу на физиологическом растворе и делали двукратные разведения вакцины от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки планшета одного ряда разливали физиологический раствор по 0,05 см3. В первую лунку планшета вносили равный объём вируса, трехкратно пипетировали и переносили 0,05 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки удаляли 0,05 см3 и обезвреживали в 2%-ном растворе ед кого натрия. После разведения вируса во все лунки вносили 1% взвесь эритроцитов в объёме, равном исходному объёму физиологического раствора 0,05 см3. Планшеты встряхивали и оставляли при комнатной температуре 18-200С. Учёт реакции проводят через 60-90 мин. Контролем эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию служили две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором (в равных объёмах). РГА оценивали положительно при оседании эритроцитов в виде хорошо выраженного «зонтика», а отрицательно - в виде «пуговки». За титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика». Реакцию задержки гемагглютинации проводили в ряду лунок (по 10-12 лунок в ряду), внося по 0,025 см3 физиологического раствора, затем добавляя в первые лунки по 0,025 см3 испытуемые и контрольные (положительная и отрицательная) сыворотки, предварительно разведенные 1:2 и прогретые для инактивации термолабильных ингибиторов, и готовили их двукратные разведения, начиная с 1:4 до 1:9192. После этого вносили специфический антиген в рабочем разведении, содержащем 4 ГАЕ. Одновременно ставили следующие контроли: • контроль рабочего разведения специфического антигена на физиологическом растворе; • контроль сывороток на наличие неспецифических гемагглютининов (в разведении от 1:4 до 1:256) на физиологическом растворе. Пластины выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре или при 370 С, после чего вносили по 0,05 см 1,0%-ной взвесь эритроцитов человека группы 0 (I) и ставили контроль на спонтанную агглютинацию эритроцитов (0,05 см3 физиологического раствора + 0,05 см3 эритроцитов). После 50-60 минут инкубации при комнатной температуре проводили учет результатов. В контролях эритроцитов на спонтанную агглютинацию и контролях сывороток на наличие неспецифических гемагглютининов эритроциты должны оседать в виде точки или компактного кольца. В контроле рабочего разведения антигена агглютинация эритроцитов должна быть в виде «зонтика» в первых четырёх лунках. Титром антител в сыворотках крови считали 40 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Иммуностимулирующее действия сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина при вирусной геморрагической болезни кроликов. наивысшее её разведение, которое даёт полную задержку гемагглютинации. Результаты исследований Проведённые опыты in vivo показали, что использование комбинации сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина с инактивированной вакциной против вирусной геморрагической болезни кроликов существенно активировало иммунитет в сравнении с консервативным использованием вакцин. Как было показано ранее, что сополимер стимулирует как гуморальное, так и клеточное звено в организме, за счёт активации выработки интерлейкина-Ы и интерлейкина-ф, а также выброса в периферическую кровь клеточных элементов кроветворения [7, 11]. Так в 1 и 2 группе животных, вакцинированных без сополимера, уровень вируснейтрализу-ющих антител составлял 1:4 в реакции задержки гемагглютинации на 14 сутки и практически отсутствовал спустя три недели, что совпадало со значениями контрольной группы. Использование комбинации вакцины в разведении 1:50 с иммуностимулирующим препаратом повысило уровень антител до 1:16 даже на 21 сутки. При этом проверка активности иммунитета путём контрольного заражения кроликов вирулентным вирусом в дозе 1000 ЛД 50 на 21 сутки после вакцинации с сополимером в дозе 150 мкг/кг показала 100% выживаемость животных опытной 4 группы, по сравнению с 80-100% гибелью в остальных. Использование сополимера совместно с вакциной в большем разведении также позволило поднять уровень вируснейтрализующих антител до 1:4 на 21 сутки у 50% особей в 5 и 6 группах. Таким образом, используя различные комбинации сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина с инактивированной вакциной против вирусной геморрагической болезни кроликов, было показано, что активация иммунитета у кроликов была достигнута однократным введением вакцины в разведении 1:50 с сополимером в дозе 150 мкг/кг и предохраняла от гибели 100 % животных опытной группы.