STUDY OF THE COMMON WORMWOOD ALLERGOID

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Пыльца полыни горькой (лат. Artemisia absinthium) является одним из сильных аллергенов в средней полосе России, в Европе и ряде других регионов. Является многолетним травянистым растением семейства Астровых, которое легко приспосабливается к различным условия, вытесняя другие виды. Поэтому во многих регионах является инвазивным видом.

У полыни есть ботаническое родство и перекрестная реактивность с другими растениями, такими как амброзия, что может вызывать клинически значимые реакции. Белок Art v 1, который присутствует в полыни, является мажорным и специфическим маркером аллергии и помогает определить, чувствительность человека к полыни и перекрестной реактивности.

Несмотря на то, что полынь известна на протяжении веков и используется в народной медицине при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и мочевыводящих путей, лихорадке и гельминтозах, у подверженных людей вызывает аллергию. Клинические симптомы весьма разнообразны: аллергический риноконъюнктивит, бронхиальная астма, атопический дерматит, пищевая аллергия [1-3].

Аллерген-специфическая терапия (АСИТ) в настоящее время считается единственным продуктивным методом лечения аллергии, поскольку она непосредственно влияет на разные фазы развития болезни, корректируя реакцию тела на аллерген. Уровень эффективности данной терапии достигает 80-90% и показывает снижение клинических проявлений и уменьшением потребности в медицинских препаратах. Аллергоиды отличаются от аллергенов тем, что сохраняют свою иммуногенность, значительно снижая при этом вероятность аллергических реакций, что делает их более безопасными для использования в аллерген-специфической терапии.

Использование нативных экстрактов аллергенов для подкожного введения в рамках АСИТ (аллергенспецифическая иммунотерапия) влекут серьезные потенциальные риски IgE-опосредованных реакций. Аллергоид, в отличие от аллергена, решает в значительной мере данную проблему, сохраняя иммуногенность, но значительно теряя аллергенность, что и делает его более безопасным для использования при АСИТ [4-6].

Аллергоиды, производимые в России компанией «Микроген», создаются путем полимеризации с использованием 1% формалина. Этот метод позволяет исключить из производственного процесса высокотоксичный элемент. Применение глутаральдегида также ускоряет этот процесс до 24 часов, по сравнению с 30 сутками, затрачиваемыми при использовании только формалина.

Сама структура аллергоида полученная с помощью химической модификации аллергена более стабильна, что делает её устойчивой к денатурации. Кроме стабильной структуры, происходит химическая инактивация IgE-комплементарных антигенных детерминант, что в свою очередь приводит к снижению аллергенности. Именно это снижение аллергенности делает использование аллергоида безопасным, минимизируя риск развития анафилаксии. Третий важный момент – происходит укрупнение молекул белка, что приводит к повышению иммуногенности [2, 7-8].

ЦЕЛЬ

После получения очищенного аллергена из пыльцы полыни горькой (лат. Artemisia absinthium) изготовить аллергоид методом глутарирования. Провести оценку свойств полученного аллергоида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования: пыльца полыни горькой, собранная в 2020 году в период цветения. Остаточная влажность после высушивания 3±0,5%. Пыльцу характеризовали по морфологическим признакам (диаметр пыльцевого зерна, структура экзимы, форма пыльцевого зерна). Допускалось не более 10% примесей других видов пыльцы (определялось микроскопическим способом). Содержание тяжёлых металлов в сульфатной золе из 1 г пыльцы (точная навеска) не более 0,001%. Заражённость растительной пыльцы амбарными вредителями не превышала I степени чистоты (что отвечает требованиям). Все показатели отвечали требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания.

После обезжиривания пыльцы диэтиловым эфиром раствор фильтровали и высушивали с помощью складчатого фильтра. Далее проводили водно-солевую экстракцию раствором бикарбоната аммония. Полученный экстракт центрифугировали, собирали надосадочную жидкость и последовательно фильтровали через фильтры с различным диаметром пор. Затем проводили диализ надосадочной жидкости против апирогенной воды. Диализат повторно центрифугировали выполняли стерилизующую фильтрацию. Полученные аллергены лиофильно высушивали и использовали в дальнейших исследованиях.

Очищенный аллерген растворяли в фосфатно-буферном физиологическом растворе (phosphate-buffered saline, PBS) рН 7,5 и проводили полимеризацию в 0,1% растворе глутарового альдегида. Реакционную смесь инкубировали сутки при температуре 8–10ºС, периодически перемешивая. Полученный раствор аллергоида по окончании срока инкубации стабилизировали раствором боргидрида натрия в течение 2 ч при комнатной температуре, затем диализовали против апирогенной воды на холоде в течение 24 ч. Диализат центрифугировали и проводили стерилизующую фильтрацию. Полученный аллергоид лиофильно высушивали и использовали в дальнейших исследованиях. Оценка содержания белка проводилась по методу Лоури (метод А).

Хроматографический анализ аллергенов полыни горькой выполняли с помощью хроматографической системы среднего давления FPLC Pharmacia Biotech (Швеция). Использовали колонку Superdex 200HR 10×30, предварительно откалиброванную по белкам с известной молекулярной массой (IgG 150 кДа, бычий сывороточный альбумин 66 кДа, пероксидаза хрена 44 кДа). Скорость потока 0,5 мл/мин; детектирование при 280 нм, объём образца 0,2 мл.

Специфические IgE-антитела человека определяли с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Постановка проводилась с использованием набора реагентов «АллергоИФА-специфические IgE» фирмы «Алкор Био» (Россия), необходимого для количественного определения в сыворотке крови человека специфических IgE. В данном наборе сорбция моноклональных антител против IgE человека была проведена на твердой фазе (планшет для ИФА).

В авторской модификации (внесение исследуемого аллергена в конкуренции с биотинилированным аллергеном) провели конкурентный анализ. В каждую лунку планшета было внесено по 50 мкл пулированной сыворотки лиц с высокой сенсибилизацией к исследуемому аллергену. Далее вносили 50 мкл исследуемого препарата в заданных количествах (5; 2,5; 1,25; 0,625, 0,31 и 0,155 мкг/лунку) и 50 мкл коммерческого биотинилированного аллергена. Исследуемый препарат – исследуемый аллерген, разведенный на фосфатном солевом буфере (Sigma Aldrich, США). В контрольную лунку были внесены только 50 мкл биотинилированного аллергена и 50 мкл фосфатного солевого буфера (Sigma Aldrich, США).

После выдерживания на шейкере в течение 1 ч при температуре 37 ± 3 °С 5-кратно промывали раствором для промывания. Далее в каждую лунку вносили по 150 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (Алкор Био, Россия). Снова выдерживали на шейкере в течение 1 ч при температуре 37 ± 3 °С и 5-кратно промывали раствором для промывания. В конце вносили в каждую лунку по 100 мкл хромогена (тетраметилбензидин, ТМБ двухкомпонентный, Алкор Био, Россия) и выдерживали на шейкере 15 мин при температуре 37 ± 3 °С. Реакцию останавливали стоп-реагентом (серной кислотой). Результаты колориметрической реакции определяли, измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм с помощью многоканального спектрофотометра Multiscan mcc/340 (Labsystems Titertek, Finland).

Количество циркулирующих специфических IgG-антител в сыворотках мышей определяли с использованием модифицированных коммерческих наборов Mouse IgG ELISA Kit (Sigma Aldrich, США). Вместо планшета из набора с сорбированными антителами против IgG мыши мы использовали планшеты Grainer high binding с сорбированным на них очищенным аллергеном. Сорбцию раствором аллергена в концентрации 10 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5–9,7 (таблетированный, ПанЭко, Россия), проводили в течение 24 ч при 8 °С. Далее исследование выполняли согласно инструкции к набору Mouse IgG ELISA Kit (Sigma Aldrich, США). Оптическую плотность определяли на многоканальном спектрофотометре Multiscan mcc/340 (Labsystems Titertek, Финляндия) при длине волны 450 нм.

Иммунизацию лабораторных животных проводили на 104 особи, самцов мышей, весом 18–22 г линии CBA × C57Bl/6 (F1). Доза аллергена или аллергоида, вводимая внутрибрюшинно одной особи, составила 20 мкг/мышь (группы 1 и 2) и 100 мкг/мышь (группы 3 и 4). В качестве растворителя использован PBS (Sigma Aldrich, США), рН 7,2–7,4. Для создания депо препарата в организме животного использовали адъювант – гидроксид алюминия Al(OH)3 в дозе 2 мг/особь. Соотношение объемов препарата и адъюванта 1:1, на одну особь 100 мкг аллергоида или аллергена в 0,1 мл PBS и 2 мг Al(OH)3 в 0,1 мл PBS, pH 7,2–7,4. Общий объем смеси, вводимой внутрибрюшинно, на одно животное составил 0,2 мл [3, 9-12].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате исследования аллергена и аллергоида методом гель-хроматографии, представленные на рис.1, произошла полимеризация. На хроматограмме видно, что исходный продукт представляет собой многокомпонентный пик в диапазоне ниже 44 кДа. Полученный аллергоид (АДП) представляет собой многокомпонентный пик. Наибольшее количество белка в аллергоиде находится в диапазоне молекулярных масс 44-66 кДа. Видно, что в результате полимеризации произошло увеличение молекулярной массы аллергоида в сравнении с исходным аллергеном (АНП). Предварительно колонка была откалибрована по белкам с известной молекулярной массой, вершины пиков калибраторов обозначены стрелками на верхней границе хроматограмм.

Известно, что аллергоиды, после полимеризации, характеризуются снижением способности связываться со специфическим IgE в сравнении с исходным аллергеном, что подтверждает снижение аллергенности. В конкурентном реверсивном ИФА сравнивали IgE-связывающую способность аллергена и конечного продукта – аллергоида. При выполнении ИФА использовали коммерческие жидкий биотинилированный аллерген (Алкор Био, Россия). Результаты оценивали по точке 50 % снижения ОП исследуемого образца по отношению к положительному контролю (точка 50% ингибирования). Результаты представлены в табл. 1. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, точка 50% ингибирования в конкурентном ИФА для аллергоида определяется при концентрации препарата 5 мкг/лунку, а при конкуренции с биотинилированным аллергеном эта точка находится между 0,31 мкг/лунку и 0,155 мкг/лунку. Значения оптической плотности колориметрической реакции приведены при 450 нм в конкурентном ИФА (ОП450) (в числителе) и % ингибирования (в знаменателе).

Иммуногенную активность исследовали на мышах, разделенных на 4 опытных группы по 24 мыши, и интактную группу из 8 мышей. Через 1, 2, 3 и 4 недели после начала иммунизации животных выводили из эксперимента и в их сыворотке методом ИФА определяли количество циркулирующих специфических IgG-антител. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, большей иммуногенной активностью при однократной иммунизации, особенно в дозе 100 мкг/мышь, обладал аллергоид в сравнении с исходным аллергеном. Уровни специфических IgG-антител при однократной иммунизации животных постепенно возрастали до 4-й недели исследования. При этом средняя оптическая плотность реакции ИФА, свидетельствующая о количестве IgG, в группе иммунизированных аллергоидом не менее чем в 1,5 раза превышала значения для аллергена, его исходного продукта. Следовательно, в результате полимеризации глутаровым альдегидом усилилась способность аллергоида к индукции синтеза специфических IgG-антител, что необходимо для эффективного проведения АСИТ.

ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью экстракции из образцов пыльцы полыни горькой, собранной в 2020 году в период цветения, был получен препарат аллергена, который стал основой для создания аллергоида. Для повышения безопасности препарата для химической модификации аллергена был использован глутаральдегид вместо формальдегида. Это позволило исключить из итогового продукта формальдегид и метанол, образующегося в результате инактивации альдегидных групп боргидридом натрия.

Снижение аллергенной активности являлось немаловажной задачей при получении аллергоида. Это было продемонстрированно с помощью конкурентного реверсивного ИФА в сравнении с исходным аллергеном и полученным аллергоидом. Гораздо более высокая концентрация препарата аллергоида, требуемая для 50% ингибирования в конкурентном ИФА, по сравнению с аллергеном, позволяет сделать вывод о снижении аллергенной активности, что с практической точки зрения говорит о снижении возможных анафилактических реакций.

Увеличение молекулярной массы аллергоида полыни, изготовленного методом глутарирования, не только снизило аллергенность препарата за счёт уменьшения общего количества активных антигенных детерминант, но и повысив его иммуногенную активность. Повышение индукции синтеза специфических IgG-антител у группы мышей иммунизированных аллергоидом полыни, так же демонстрирует перспективность для дальнейшего изучения препарата для использования при АСИТ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Безопасность и эффективность является неотъемлемой частью каждого препарата. В настоящий момент главным болезнь-модифицирующим методом лечения IgE-опосредованных аллергических заболеваний остаётся АСИТ. Препараты АСИТ, основанные на нативных экстрактах, сохраняют высокий риск развития возможных анафилактических реакций.

Полученный аллергоид из пыльцы полыни горькой методом глутарирования обладает высокой иммуногенностью и низкой аллергенной активностями по сравнению с исходным аллергеном, что делает возможным его дальнейшее изучение и после применения для АСИТ.

Замена формальдегида на глутаральдегид повысила безопасность как производства, так и конечно продукта, убрав возможные остаточные количества формальдегида и метанола, образующегося в результате инактивации альдегидных групп боргидридом натрия.

About the authors

Daria Esaulova

Email: esaulova.d.r@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0283-5637
Россия

Ksenia O. Nechay

National Research Center ― Institute of Immunology

Email: xenya.ne4ay2016@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6052-9721
SPIN-code: 7206-6660
Россия, Moscow

Alexandr I. Andreev

National Research Center ― Institute of Immunology

Email: cahek_ahdreeb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6257-6289
SPIN-code: 7126-4748
Россия, Moscow

Ilina Amangalieva

Email: amulishhha@inbox.ru

Igor V. Andreev

National Research Center ― Institute of Immunology

Author for correspondence.
Email: iva66@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6162-6726
SPIN-code: 8072-9669

MD, Cand. Sci. (Med.)

Россия, Moscow

Tatiana V. Latysheva

National Research Center — Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: tvlat@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1508-0640
SPIN-code: 8929-7644

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Россия, Moscow

Nailya Kh. Setdikova

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia; Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov

Email: nh.setdikova@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0003-2587-7928
SPIN-code: 6339-6945

MD, Dr. Sci. (Med.), Leading Research Associate

Россия, 24, Kashirskoye shosse, Moscow, 115522; Moscow

Elena A. Latysheva

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: ea.latysheva@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0002-1606-205X
SPIN-code: 2063-7973

MD, Dr. Sci. (Med.)

Россия, Moscow

Georgy O. Gudima

National Research Center — Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: goudima@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2864-6949
SPIN-code: 5307-9425

Dr. Sci. (Biol.)

Россия, Moscow

Valerii V. Smirnov

National Research Center — Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia; The First Sechenov Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: vall@mail.mipt.ru
ORCID iD: 0000-0002-8232-6682
SPIN-code: 4171-3871

Dr. Sci. (Pharm.), Professor

Россия, Moscow; Moscow

Аlexander I. Martynov

National Research Center ― Institute of Immunology

Email: immune48@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9761-8058
SPIN-code: 5829-5580

MD, Cand. Sci. (Med.)

Россия, Moscow

Musa R. Khaitov

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia; Peoples' Friendship University of Russia; The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Email: mr.khaitov@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0003-4961-9640
SPIN-code: 3199-9803

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding member of the Russian Academy of Sciences

Россия, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files