Anti-inflammatory activity of the antiallergic drug 7-[4-(4-benzhydrylpiperazinyl-1)butyl]-3-methylxanthine succinate (theoritin)

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

Background: Many antagonists of H1 receptor, in addition to antihistamine action, suppress allergic inflammation by inhibiting the formation and secretion of proinflammatory cytokines. The new antiallergic drug benzhydrylpiperazinyl butylmethylxanthine succinate (theoritin), which has an antihistamine activity comparable to the known H1-antihistamines of the 2nd generation, surpasses them in the ability to suppress the allergic inflammatory reaction, which allows this drug to have additional anti-inflammatory properties associated with inhibition of the formation of pro-inflammatory cytokines.

Aim: To determine the effect of theoritin on the induced release of the proinflammatory cytokines interleukin (IL)-6, IL-8 and tumor necrosis factor (TNF)α in cell culture in comparison with the action of the inverse agonist of H1 receptors cetirizine and a known inflammation inhibitor - glucocorticosteroid dexamethasone.

Materials and methods: U937 cells differentiated towards macrophage-like cells were used. The cytotoxicity of the substances used was assessed in the methyltetrazolium test at different incubation times (up to 24 h). Cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS). The tested compounds (theoritin and cetirizine) were tested at concentrations from 0.001 to 100 μM, dexamethasone - 10 μM when added to cells 1 hour before ("prophylactic effect") or 1 hour after ("therapeutic effect") the addition of LPS. Determination of IL-6, IL-8 and TNFα in supernatants was carried out by enzyme immunoassay.

Results: For cetirizine and theoritin, the absence of cytotoxic action was shown within the tested concentrations and time intervals. Dexamethasone inhibited formation of IL-6 and TNFα to the initial level, and IL-8 - by 50-60%. Theoritin led to a significant concentration-dependent decrease in the LPS-induced production of IL-6, IL-8, and TNFα, and at a concentration of 100 μM the effect of theoritin was comparable to that of dexamethasone at a concentration of 10 μM.

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Вопрос о целесообразности создания полифункциональных противоаллергических фармакологических средств возник после того, как стало очевидным, что вызванная аллергеном реакция клеток-мишеней (в первую очередь тучных клеток и базофилов) не является результатом их повреждения, а представляет собою процесс активации функции клеток, приводящий к секреции медиаторов аллергии [1, 2]. Отсюда следовало, что перспективным способом фармакологического контроля аллергической реакции является совмещение антагонистического действия по отношению к медиаторам аллергии с торможением функции клеток–мишеней с целью подавления секреции медиаторов. В процессе реализации такого подхода были получены соединения, представляющие собою модификации ксантинового ядра фармакоформными группами соединений, обладающих свойствами обратных агонистов (противогистаминное действие) [3], в частности, с использованием оригинальных хинуклидиновых производных, созданных группой М.Д. Машковского [4]. Такие модифицированные структуры сочетали противогистаминное действие на уровне рецептора с торможением вызванной аллергеном секреции этого медиатора из тучных клеток крыс и базофилов человека [3], т.е. обладали полифункциональным противоаллергическим действием. При фармакологическом изучении Н1-антигистаминных препаратов оказалось, что большинство из них проявляют дополнительное противовоспалительное действие за счет подавления образования и секреции провоспалительных цитокинов, т.е. имеют полифункциональную противоаллергическую активность, а определение таких свойств у новых противогистаминных препаратов стало широко используемым подходом [5, 6].

В последующем были выполнены расширенные исследования Р.Г. Глушковым и сотрудниками с целью подбора оптимальных условий синтеза модификаций ксантинового ядра соединениями с Н1-антигистаминной активностью, отвечающих запросам клинической медицины. Так, в результате модификации ксантинового ядра бензгидрилпиперазиноалкильным фрагментом, являющимся основной частью структуры современных высокоэффективных обратных агонистов Н1-рецепторов (в частности, цетиризина), было получено длительно действующее и малотоксичное соединение 7-[4-(4-бензгидрилпиперазинил-1)бутил]-3-метилксантина сукцинат (теоритин), обладавшее сопоставимым с действием препарата сравнения (цетиризином) противогистаминным эффектом, но превышавшим способность цетиризина подавлять кожную аллергическую реакцию [7, 8]. Последнее могло указывать на усиление противоаллергического действия теоритина за счет ксантинового ядра, обусловливающего дополнительный противовоспалительный эффект. Это, в свою очередь, обосновывало оценку способности теоритина влиять на образование и высвобождение провоспалительных цитокинов, участвующих в организации аллергического воспалительного ответа.

 

ЦЕЛЬ

В настоящей работе исследовано влияние теоритина в сопоставлении с действием препарата сравнения (цетиризина) и стандартного противовоспалительного агента дексаметазона на индуцированное липополисахаридом (ЛПС) в условиях культивирования клеток образование и высвобождение ключевых провоспалительных цитокинов – интерлейкина (ИЛ)-6, ИЛ-8 и фактора некроза опухоли (ФНО)α.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы субстанции следующих препаратов: теоритин (Теоритин® МФ - бензгидрилпиперазинилбутилметилксантина сукцинат, ЗАО «Обнинская химико-фармацевтическая компания», Россия) [7], цетиризин дигидрохлорид (BLD Pharamatech Ltd., США) и дексаметазон (МНН: дексаметазон, Elfa Laboratories, Индия).

Клетки. Использовали суспензионную культуру клеток гистиоцитарной лимфомы человека U937 [9]. Клетки получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 (ООО Биолот, Россия), содержащей 10% сыворотки плода коровы (HyClone, США), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, при температуре 37 °C в атмосфере 5% CO2. Пересев клеток производили раз в 3-4 дня при достижении плотности свыше 2 млн кл./мл путем разведения клеточной суспензии свежей питательной средой в соотношении 1:10.

Дифференцировка клеток. Дифференцировку клеток U937 в макрофаги проводили в культуральных флаконах для адгезионных клеток площадью 75см2 (Nunc, США) с использованием форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 35 нг/мл. В течение первых 24 ч клетки инкубировали в питательной среде с добавлением ФМА для перехода клеток из суспензионной формы в адгезионную. После этого проводили отмывку от неприкрепившихся к пластику клеток и продолжали культивирование в питательной среде с добавлением ФМА еще 24 ч, после чего клетки с культуральных флаконов рассевали в лунки планшетов для проведения дальнейших экспериментов.

Изучение цитотоксического действия теоритина и цетиризина на клетки линии U937. Цитотоксичность субстанций оценивали с использованием метилтетразолиевого теста (МТТ-тест) через 3, 6, 12, 24 ч после добавления субстанций к дифференцированным клеткам U-937. МТТ-тест позволяет количественно оценить способность митохондриальных НАДФ-H-зависимых оксидоредуктаз живых клеток превращать бледно-желтый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) (Sigma-Aldrich, США) в фиолетовые кристаллы формазана [10]. В лунки 96-луночных планшетов (Nunc, США), содержащих по 105 клеток вносили десятикратные разведения субстанций (теоритина и цетиризина) с созданием конечных концентраций в диапазоне от 100 мкМ до 0,00001 мкМ (каждую концентрацию субстанций исследовали в 6 повторах). Планшеты инкубировали в течение 1, 4, 10, 22 ч при температуре 37 оC в атмосфере 5% CO2. После этого в лунки добавляли по 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в питательной среде) и инкубировали дополнительно 2 ч. Затем лунки освобождали от супернатантов, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, ООО Биолот, Россия) и измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны поглощения 550 нм за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм на планшетном спектрофотометре xMark (BioRad, США). Жизнеспособность клеток в присутствии испытуемых веществ выражали в процентах, используя формулу: (ОП опытных лунок – ОП среды) / (ОП контрольных лунок – ОП среды) × 100%, где ОП — оптическая плотность.

Оценка способности теоритина и цетиризина влиять на индуцированную ЛПС продукцию цитокинов дифференцированными клетками U937. Противовоспалительное действие исследуемых субстанций оценивалось по изменению количества продуцируемых провоспалительных цитокинов при использовании 2 схем внесения препаратов: профилактической и лечебной. В лунки 24-луночных планшетов, содержащих 106 дифференцированных клеток U-937 в 800 мкл питательной среды, вносили по 100 мкл десятикратных разведений исследуемых субстанций с созданием конечных концентраций от 100 мкМ до 0,001 мкМ по двум схемам по двум схемам: «профилактической» – за 1 ч до добавления ЛПС E. coli O111:B4 (Sigma-Aldrich, США) и «лечебной» – через 1 ч после добавления ЛПС. ЛПС в объеме 100 мкл добавляли в лунку с созданием конечной концентрации 100 мкг/мл. Отрицательным контролем служили дифференцированные клетки, к которым не добавляли ЛПС и исследуемые субстанции; контролем индукции провоспалительных цитокинов являлись клетки, к которым добавляли ЛПС; в качестве контроля противовоспалительного действия использовали дексаметазон (Elfa Laboratories, Индия) в конечной концентрации 10 мкМ. Каждая схема применения субстанций препаратов была воспроизведена в 4 повторах. По истечении 6-часовой инкубации клеток после внесения ЛПС культуральную жидкость отбирали и хранили при -80 °C для последующего количественного определения продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов (АО Вектор-Бест, Новосибирск).

Статистическая обработка. Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk`s W test). Рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение от среднего. Для оценки данных с признаками нормального распределения применен t-критерий Стьюдента, а также однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим межгрупповым сравнением (post hoc analysis) критерием Даннета. Для данных цитотоксичности тестируемых объектов, выраженных в %, был применен критерий Краскелла-Уоллиса с последующим множественным сравнением средних рангов (критерий Данна). EC50 (эффективность биологического действия на уровне 50%) вычисляли при помощи четырехпараметрической аппроксимации графика зависимости % от концентрации теоритина. Статистический анализ выполняли с использованием лицензированного программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (GraphPad, США). Различия считали статистически значимыми при уровне р<0,05.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитотоксическое действие теоритина и цетиризина в конечных концентрациях от 100 до 0,00001 мкМ изучали на дифференцированных в макрофаги клетках линии U937 с использованием МТТ-теста при инкубации в течение 3, 6, 12 и 24 ч. Результаты оценки цитотоксического действия цетиризина и теоритина на дифференцированные клетки U937 представлены на рисунках 1 и 2.

Анализ жизнеспособности клеток U937 по активности митохондриальных оксидоредуктаз показал отсутствие цитотоксического действия цетиризина в диапазоне конечных концентраций от 100 мкМ до 0,01 нМ при инкубации с клетками в течение 3, 6, 12 и 24 ч. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA показал наличие статистической значимости в сравнении с отрицательным контролем (0 мкМ) для концентрации 0,001 мкМ через 12 ч инкубации (рис. 1). Ввиду отсутствия концентрационной зависимости зафиксированное отличие не является клинически значимым.

Для теоритина также показано отсутствие цитотоксического эффекта в диапазоне конечных концентраций от 100 мкМ до 0,01 нМ в период от 3 до 24 ч инкубации с клетками. Кроме того, на рис. 2 видно, что теоритин вызывает усиление активности митохондриальных НАДФ-H-зависимых оксидоредуктаз и клеточного дыхания. В частности, статистически значимое увеличение жизнеспособности клеток показано через 6 ч для концентрации 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1 и 100 мкМ (рис. 2), кроме того усиление клеточного дыхания наблюдали через 3 ч для концентрации 10 мкМ, а также через 24 ч для концентрации 0,01 мкМ. На основании полученных данных для дальнейшего изучения противовоспалительного действия разведений исследуемых субстанций были выбраны 6 концентраций как для теоритина, так и для цетиризина – 100; 10; 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мкМ.

Количественное определение изменения уровней ФНОα, ИЛ-6 и ИЛ-8 под действием исследуемых субстанций проводили иммуноферментным анализом через 6 ч после внесения к дифференцированным в макрофаги клеткам U-937 ЛПС в концентрации 10 мкг/мл. Внесение теоритина, цетиризина и в качестве контроля противовоспалительного действия – дексаметазона в конечной концентрации 10 мкМ осуществляли по двум схемам – «профилактической» за 1 ч до внесения ЛПС и «лечебной» через 1 ч после внесения ЛПС.

Внесение ЛПС в конечной концентрации 10 мкг/мл приводило к синтезу и секреции всех оцениваемых провоспалительных цитокинов – через 6 ч инкубации уровень ИЛ-6 составил от 10 до 30 пг/мл (рис. 3), уровень ИЛ-8 - от 800 до 1000 пг/мл (рис. 4) и ФНОα - от 200 до 300 пг/мл (рис. 5), по совокупности двух экспериментов.

Препарат контроля противовоспалительного действия дексаметазон из группы глюкокортикостероидов снижал выработку ИЛ-6 и ФНОα практически до фонового уровня, уровень ИЛ-8 - на 50-60%.

Показано, что добавление цетиризина в диапазоне концентраций от 0,001 до 100 мкМ как по «профилактической» схеме (за 1 ч до внесения индуктора), так и «лечебной» (через 1 ч после внесения ЛПС) не приводило к существенному снижению уровня провоспалительных цитокинов, секретируемых дифференцированными клетками U937 (рис. 3, 4 и 5). Тенденция к уменьшению образования цитокинов при испытании отдельных концентраций цетиризина не достигала статистической значимости.

Добавление в культуру клеток теоритина приводило к значимому снижению ЛПС-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-6 (рис. 3), ИЛ-8 (рис. 4) и ФНОα (рис. 5). На рис. 5 представлены результаты оценки влияния исследуемых субстанций на уровень ЛПС-индуцированной выработки ФНОα. В концентрации 100 мкМ эффект теоритина был сопоставим с действием глюкокортикостероида дексаметазона в концентрации 10 мкМ.

Для каждого цитокина и схемы внесения теоритина с применением четырехпараметрической аппроксимации графика зависимости % от концентрации теоритина с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (GraphPad, США) была вычислена EС50 – концентрация на уровне 50% эффективности. EC50 по совокупности подавления теоритином продукции трех проанализированных цитокинов находилась в диапазоне от 5,93 до 12,82 мкМ. В отношении ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα EC50 составила порядка 12,82; 9,91; 5,93 при «профилактической» схеме и 9,57; 7,04; 9,42 при «лечебной» схеме введения препарата соответственно.

Уровень ИЛ-6 при обеих схемах внесения снижался практически до исходного при добавлении теоритина в концентрации 100 мкМ.

При использовании «профилактической» схемы (за 1 ч до индукции секреции провоспалительного цитокина ИЛ-8) внесения теоритина в концентрации 100 мкМ уровень ИЛ-8 снижался ≈ до 25% от исходного и при «лечебной» схеме (через 1 ч после внесения ЛПС) ≈ до 50% от исходного (рис. 4).

Значимое ингибирование продукции цитокина ФНОα наблюдали при всех использованных концентрациях теоритина, начиная с минимальной (0,001 мкМ), при «профилактической» схеме внесения. В концентрации 100 мкМ уровень ФНОα снижался практически до 0 (рис. 5 а). При использовании схемы внесения через 1 ч после добавления к клеткам ЛПС статистически значимые отличия наблюдались для концентраций 10 и 100 мкМ (рис. 5 б).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор клеточной линии U937 в качестве объекта изучения действия теоритина на образование и секрецию провоспалительных цитокинов обусловлен несколькими обстоятельствами.

U937 представляет собою промоноцитарную клеточную линию миелоидного лейкоза человека, выделенную из гистиоцитарной лимфомы 37-летнего мужчины [11]. Промоноциты U937 дифференцируются в зрелые моноциты или макрофаги под воздействием ФМА, и эти дифференцированные макрофагальные клетки, способные продуцировать многие провоспалительные цитокины, включая ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8, были использованы для изучения функции мононуклеарных клеток человека при бронхиальной астме [12].

Исследования, выполняемые на этих клетках, имеют особую перспективность, объясняющуюся тем, что клетки U937 экспрессируют рецепторы гистамина (Н1- и Н2-типа), и экспрессия сохраняется на дифференцированных макрофагоподобнх клетках [9]. Поэтому эта модель может оказаться полезной для выяснения роли гистамина, являющегося ключевым медиатором аллергии, в стимуляции и контроле продукции провоспалительных цитокинов.

Одним из наиболее активных индукторов образования и секреции провоспалительных цитокинов этими клетками является ЛПС [13], что позволяет оценивать в стандартных условиях действие различных веществ на продукцию провоспалительных цитокинов, опосредующих развитие и поддержание разных форм воспаления, в том числе и аллергического генеза.

В настоящем исследовании теоритин и препарат сравнения цетиризин были испытаны в широких пределах концентраций, не оказывавших цитотоксического действия на дифференцированные в макрофаги клетки U937. Показано, что при использовании «профилактической» (добавление препарата за 1ч до стимуляции клеток ЛПС) схемы теоритин вызывал в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкМ зависимое от дозы угнетение секреции ИЛ-6, причем в концентрации 100 мкМ эффект был сопоставим с подавляющим действием дексаметазона (10 мкМ). Принципиально та же закономерность выявлялась при проведении испытаний по «лечебной» (добавление препарата через 1 ч после стимуляции клеток ЛПС) схеме.

Вызванное теоритином подавление секреции ИЛ-8 при испытании по «профилактической» схеме также было зависимым от дозы препарата в пределах концентраций от 1 до 100 мкМ. Действие теоритина в наивысшей использованной концентрации оказывалось сопоставимым с торможением высвобождения из клеток ИЛ-8, вызванного дексаметазоном.

При использовании «лечебной» схемы испытаний теоритин в концентрациях 10 и 100 мкМ угнетал продукцию ИЛ-8, вызванную ЛПС, приблизительно в той же степени, что и дексаметазон (10 мкМ).

Наиболее выраженное подавляющее действие теоритина проявлялось в отношении индуцированной ЛПС продукции ФНОα и было четко зависимым от дозы препарата. Достоверное торможение образования ФНОα воспроизводилось всеми испытанными концентрациями вплоть до полной блокады индуцированной продукции цитокина в условиях опыта по «профилактической» схеме. Угнетающий эффект теоритина по отношению к продукции ФНОα воспроизводился и при выполнении «лечебной» схемы испытаний, но в несколько меньшей степени.

Таким образом, полученные данные продемонстрировали достоверную и четко зависимую от дозы теоритина способность тормозить вызванную ЛПС в дифференцированных макрофагоподобных клетках U937 продукцию и секрецию всех исследованных провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОα), чем может быть подтверждено и объяснено противовоспалительное действие препарата.

В отличие от теоритина цетиризин не проявлял на использованной модели закономерного угнетающего действия на образование и высвобождение клетками провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОα). Как видно из представленных выше данных, лишь при использовании отдельных концентраций цетиризина была заметной слабовыраженная тенденция к некоторому угнетению образования и секреции цитокинов. В доступной литературе отсутствуют сведения о действии цетиризина на продукцию провоспалительных цитокинов в клетках U937. Однако исследования, выполненные на других клеточных моделях (культуре эпителиальных клеток [6, 14, 15], незрелых дендритных клеток [16], клеток назальных полипов [17], тучных клеток [18]), продемонстрировали, что выраженность действия цетиризина зависит как от использованного клеточного объекта, так и вида стимуляции секреции цитокинов (ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-6 и др.). Причем, в ряде случаев не удавалось показать соответствия этого действия зависимости «доза-ответ» [16, 18]. Поэтому данные настоящего исследования, не свидетельствующие о существенной ингибирующей способности цетиризина по отношению к секреции цитокинов, могут быть связаны с видом использованных клеток и характером стимулятора. При этом следует обратить внимание на тот факт, что при отсутствии или снижении ингибирующего сигнала цетиризина теоритин проявляет тормозящее действие на секрецию провоспалительных цитокинов.

Выявленное ингибирующее действие теоритина на секрецию медиаторов воспаления может быть связано с наличием в его структуре ксантинового производного – теобромина. Теобромин, как и другие метилксантины, является известным ингибитором фосфодиэстеразы [19, 20], за счет чего повышает внутриклеточное содержание 3',5'-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), который, как давно было установлено, тормозит секрецию медиаторов аллергического воспаления, в частности, гистамин, медленно реагирующая субстанция анафилаксии, эзинофильный хемотаксический фактор анафилаксии [21]. В последующем были получены новые свидетельства противовоспалительного действия теобромина. Так, известно, что теобромин тормозит активность ядерного фермента поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 (PARP-1), активация которого участвует в реализации острых и хронических воспалительных процессов [22]. В культуре человеческих клеток линии 3Т3-L1 теобромин тормозит продукцию и секрецию ФНОα и ИЛ-6, измеренных по содержанию мРНК и по белку [23]. Теобромин значительно снижал уровень провоспалительных цитокинов: моноцитарного хемотаксического фактора-1 и ИЛ-1β в надосадочных жидкостях, полученных от взаимодействующих зрелых адипоцитов (линии SGBS) и макрофагоподобных клеток (линии U937), что было использовано как модель воспалительного процесса in vitro [24].

Таким образом, данные настоящего исследования, свидетельствуют о том, что теоритин {7-[4-(4-бензгидрилпиперазинил-1)бутил]-3-метилксантина сукцинат}, проявляющий высокую Н1-антигистаминную активность [7], обладает свойствами противовоспалительного агента, связанными, скорее всего, с включением в его структуру 3,7-диметилксантина (теобромина). Это, в свою очередь, подтверждает ранее высказанное мнение [3, 7] о возможности получения полифункционального противоаллергического фармакологического средства модификацией противовоспалительной субстанции (производных ксантина) избирательным антагонистом Н1-рецепторов (в данном случае бензгидрилпиперазиноалкильным фрагментом).

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, приведенный выше материал свидетельствует о том, что помимо противогистаминной активности, не уступающей антигистаминному действию цетиризина и других Н1-антигистаминных препаратов 2-го поколения [7], новый противоаллергический препарат теоритин имеет дополнительный противовоспалительный потенциал, обусловленный подавлением продукции и секреции медиаторов воспаления – цитокинов ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8, что обосновывает и объясняет широкие противоаллергические возможности теоритина.

×

About the authors

Igor S. Gushchin

NRC Institute of Immunology FMBA of Russia

Author for correspondence.
Email: igushchin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4465-6509
SPIN-code: 1905-4758

MD, PhD, professor, corresponding member of Russian Academy of Sciences, head of the Departament of Clinical Immunology and Allergology

Russian Federation, 24, Kashirskoe shosse, Moscow, 115522

Kirill Leonidovich Kryshen

Email: info@doclinika.ru
ORCID iD: 0000-0003-1451-7716
SPIN-code: 5650-2840

Andrei Borisovich Bondarenko

Email: info@doclinika.ru
ORCID iD: 0000-0002-8437-1313
SPIN-code: 3376-6819

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Statistics

Views

Abstract: 158

Article Metrics

Metrics Loading ...

Dimensions

PlumX


Copyright (c) Russian Journal of Allergy

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies