Dynamics of basophil reactivity in the patients with allergic rhinitis on the background of allergen-specific immunotherapy

Full Text

Аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ) является наиболее рациональным методом лечения пыльцевой аллергии, модифицирующим болезнь с высоким уровнем доказательности [1]. Известно, что терапевтические механизмы АСИТ включают формирование аллергенспецифических регуляторных Т-клеток – природных и индуцированных Тreg [2], регуляторных В-лимфоцитов – Breg [3], эффекторных фолликулярных Т-хелперов [2]. АСИТ участвует в поляризации иммунного ответа с увеличением уровня Th1 и уменьшением количества Th2, а также лимфоидных клеток врожденного иммунитета – ILC2 (type 2 innate lymphoid cells) [2], способствуя развитию периферической иммунной толерантности [2]. Под действием иммунотерапии в десятки раз увеличивается продукция аллергенспецифических антител изотипов IgG4, IgG1, IgA [2, 4], что совпадает с клинической ремиссией. Высокоавидный и высокоаффинный сывороточный IgG4 конкурирует с IgE за связывание аллергена, блокирует образование комплекса аллерген-IgE, предотвращает дегрануляцию базофилов и тучных клеток, а также взаимодействие аллергена с В-клеточным рецептором [2, 4].

При этом одним из основных механизмов АСИТ является антигенспецифическая десенсибилизация базофилов и тучных клеток [5]. Целевая группа EAACI (European Academy of Allergy and Clinical Immunology) рассматривает тест активации базофилов (Basophil activation test – BAT) как один из биомаркеров, способных предсказать клинической ответ на АСИТ у пациентов с аллергическим ринитом [4].

Цель исследования состояла в оценке реактивности базофилов у сенсибилизированных пыльцой сорных трав пациентов, получавших АСИТ.

При планировании исследования поставлены следующие вопросы:

1. Каковы изменения спонтанной и индуцированной реактивности базофилов на фоне АСИТ пыльцой сорных трав?
2. Зависят ли показатели BAT от результатов АСИТ?

Материалы и методы

Дизайн исследования. Работа выполнена в дизайне обсервационного одноцентрового открытого проспективного плацебонеконтролируемого исследования.

Критерии соответствия. В исследование включены пациенты старше 16 лет с установленным диагнозом «Аллергический ринит, вызванный пыльцой сорных трав», имевшие показания к проведению АСИТ. Диагноз устанавливали на основании Федеральных клинических рекомендаций [6] и рекомендаций ARIA 2018 (Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma) [7]. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Из исследования исключали пациентов, ранее получавших курсы АСИТ, имевших противопоказания к проведению иммунотерапии, развивших выраженные аллергические реакции в процессе лечения, беременных и кормящих грудью женщин.

Условия проведения. Исследование проводилось на базе аллергологического кабинета Краевого клинического консультативно-диагностического центра г. Ставрополя (АНМО «СККДЦ») в 2018–2020 гг.

Продолжительность исследования. Работа выполнялась в течение 2 лет. На первом этапе исследования у пациентов, отобранных для АСИТ, проводили клинические, инструментальные и лабораторные исследования, кожные пробы с аэроаллергенами (prick-тесты), определение аллергенспецифических IgE к мажорным аллергенам пыльцы деревьев и трав, тест активации базофилов. На втором этапе исследования осуществляли катамнестическое наблюдение пациентов для мониторинга BAT и оценки клинической эффективности АСИТ. Забор периферической крови для определения реактивности базофилов проводили до лечения, после окончания первого и второго предсезонных курсов АСИТ. Визиты к аллергологу для мониторинга клинических симптомов аллергического ринита (АР) назначали через 6 и 18 мес от начала АСИТ.

Описание медицинского вмешательства. Выбор препарата для АСИТ осуществлялся на основании результатов кожных проб и показателей аллергенспецифических IgE к мажорным аллергенам в сыворотке крови. У пациентов с моносенсибилизацией к пыльце амброзии использовали водно-солевой аллерген амброзии, у больных с олигосенсибилизацией – аллергены амброзии и полыни, с полисенсибилизацией – комбинации аллергенов: амброзия + полынь, амброзия + тимофеевка, амброзия + береза. Инъекции осуществляли в разные конечности с 30-минутным интервалом между введением первого и второго аллергена. Лечение начинали в январе-феврале, за 3–4 мес до начала цветения. Проведено два предсезонных курса АСИТ. Первый курс лечения завершили 52 пациента, второй курс – 43. Для подкожной иммунотерапии применяли водно-солевые экстракты пыльцевых аллергенов амброзии, полыни, тимофеевки и березы (ФГУП НПО «Микроген», г. Ставрополь) в соответствии с медицинской инструкцией по применению препарата. Средняя курсовая доза аллергена достигала 3200 PNU. АСИТ проводилась в условиях аллергологического кабинета. После введения аллерговакцины за пациентом наблюдали не менее 40 мин. В случае возникновения нежелательных реакций регистрировали их частоту и выраженность. Лечение прекращали при развитии системных осложнений в виде распространенной уртикарной сыпи и ангиоотека мягких тканей лица, бронхоспазма, снижения артериального давления.

Основной исход исследования. Определение спонтанной и индуцированной активации базофилов выполняли до лечения, через 3 и 15 мес от начала иммунотерапии. При мониторинге данных оценивали медиану BAT, а также процент проб, в которых наблюдалось снижение реактивности базофилов по сравнению с показателями до лечения.

Дополнительные исходы исследования. Клиническую оценку эффективности АСИТ проводили через 6 и 18 мес от начала иммунотерапии. Результативность АСИТ оценивали по балльной шкале, разработанной А.Д. Адо [8], а также с учетом клинических данных, оцененных с использованием шкалы RTSS (Rhinoconjunctivitis total symptom score) [4].

Анализ в подгруппах. Обследованы 60 больных в возрасте от 16 до 55 лет с АР (22 женщины, 38 мужчин), сенсибилизированных к пыльце сорных трав (табл. 1). В 68,3% случаев в структуре коморбидной патологии диагностировались аллергический конъюнктивит, в 16,7% – бронхиальная астма (БА), в 11,7% – пищевая аллергия, в 26,7% – атопический дерматит (АтД).

 

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов с АР, получавших АСИТ

Показатель	Значение
Возраст, лет	23,03±1,22
Пол, м/ж	22/38
Легкое течение, %	15,0
Среднетяжелое течение, %	73,3
Тяжелое течение, %	11,7
Конъюнктивит, %	68,3
Аллергическая бронхиальная астма, %	16,7
Атопический дерматит, %	26,7
RTSS, баллы	13 [10; 15]
IgE общий, МЕ/мл	331 [149; 605, 5]
Аллергенспецифический IgE к nAmb a 1, кЕ/л	41,9 [1, 62; 71, 4]
Аллергенспецифический IgE к nArt v 1, кЕ/л	1,25 [0, 01; 3, 89]

 

При постановке кожных проб и определении аллергенспецифических IgE у 12 (20%) пациентов установлена моносенсибилизация к пыльце амброзии, у 12 (20%) – олигосенсибилизация к амброзии и полыни, у 12 (20%) – полисенсибилизация к сорным травам – полыни, амброзии, подсолнечнику, лебеде, циклахене, у 17 (28,3%) – к сорным травам и тимофеевке, у 7 (11,7%) – к сорным травам и березе.

Антитела к мажорному аллергену амброзии nAmb a 1 выявлены у 49 (81,7%) больных, полыни (nArt v 1) – у 16 (26,7%), тимофеевки (rPhl p 1, 5) – у 17 (28,3%), березы (Bet v 1) – у 7 (11,7%).

Методы регистрации исходов. Клинические и инструментальные исследования включали анализ аллергологического анамнеза, клинический осмотр, определение степени тяжести АР, переднюю риноскопию, при необходимости – рентгенологическое исследование околоносовых пазух, компьютерную томографию и эндоскопическое исследование полости носа и околоносовых пазух [6]. При оценке клинических данных использовали результаты клинического мониторинга и данные дневника самоконтроля в период пыления причинно-значимых растений. В дневниках самонаблюдения пациенты ежедневно регистрировали интенсивность клинических симптомов поллиноза, сведения о принимаемых лекарственных препаратах. Врач анализировал 6 клинических признаков заболевания – затруднение носового дыхания, чихание, ринорею, зуд в полости носа, слезотечение, зуд глаз. Применялась балльная шкала RTSS: отсутствие признака – 0 баллов, минимальная выраженность симптомов – 1 балл, умеренная – 2 балла, максимально высокая – 3 балла. Количество баллов за сутки колебалось в пределах от 0 до 18 [4].

Наличие IgE к компонентам аллергенов березы повислой (Bet v 1, rBet v 2, rBet v 4), тимофеевки луговой (rPhl p 1, rPhl p 5b, rPhl p 7, rPhl p 12), амброзии полыннолистной (nAmb a 1), полыни обыкновенной (nArt v 1, nArt v 3) регистрировали методом непрямой иммунофлуоресценции ImmunoСap с использованием тест-cистемы Phadiatop на иммунохемилюминесцентном анализаторе Phadia 100 (Швеция).

Оценка уровня активации базофилов в ответ на аллергены (BAT) in vitro проводилась методом проточной цитометрии с использованием набора Allergenicity Kit Beckman Coulter (США) в спонтанных и стимулированных условиях. В качестве аллергенов для активации использовали аллергены фирмы Buhlmann Laboratories AG (Германия) – BAG-T3-береза бородавчатая (Betula); BAG-W1-амброзия полыннолистная (Ambrosia); BAG-W1-6-полынь обыкновенная (Artemisia); BAG-G6-тимофеевка луговая (Phleum). Аллергены для стимуляции выбирали в зависимости от спектра сенсибилизации пациента. Для каждого образца крови готовили по 3 пробы: проба «Neg» – отрицательный контроль; проба «Pos» – положительный контроль; проба «Test» – исследуемый аллерген. Для исследования в каждую пробирку вносили по 100 мкл цельной крови с ЭДТА. Затем добавляли по 20 мкл моноклональных антител CD203c-PE/CD3-PC7/CRTH2-FITC. В пробирку с отрицательным контролем вносили 20 мкл фосфатно-солевого буфера ФСБ, в пробирку с положительным контролем – 20 мкл рабочего раствора положительного контроля, в 3-ю пробирку – 20 мкл исследуемого аллергена. Для усиления процесса активации во все пробирки добавляли по 100 мкл активирующего раствора. Содержимое пробирок аккуратно перемешивали на Vortex, затем инкубировали при 37 ºС в течение 15 мин в термостате. Для остановки процесса активации изучаемых клеток в каждую пробирку вносили по 100 мкл стоп-раствора, содержащего 0,1% раствор азида натрия (NaN₃).

Анализ проводили на лазерном проточном цитометре Navios, Beckman Coulter (США). Базофилы идентифицировали по экспрессии CRTH2 и CD203c. Активированные базофилы in vitro определяли по фенотипу CRTH2⁺ CD203^brightCD3^–. Сбор данных останавливали после набора 500 базофилов, что соответствовало 130 000–300 000 проанализированных лейкоцитов. Для оценки реактивности базофилов использовали показатели спонтанной и стимулированной активации, а также индекс стимуляции (ИС) BAT, определяемый как соотношение процента активированных базофилов в пробах с аллергеном к уровню их активации в негативном контроле (ИС BAT_стим./BAT_спонт.). Для пациентов, сенсибилизированных как к пыльце сорных, так и луговых трав и/или деревьев, проводили два и более тестов активации базофилов с соответствующими аллергенами. Снижение количества CD203-позитивных базофилов после первого и второго курсов АСИТ учитывали, если отмечалось уменьшение аллергенстимулированной активации базофилов в 1,2 раза и более.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 61 от 18.01.2017 г.).

Статистический анализ. Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистические методы исследования выполняли с использованием специализированных лицензионных программ Statistica SPSS и Primer of Biostat 4,0. Количественные значения представляли в виде медианы и интерквартильного (25-й и 75-й процентили) размаха [Me (Q₁–Q)]. Для оценки межгрупповых различий применяли однофакторный дисперсионный анализ, критерии Крускала–Уоллиса, Ньюмена–Кейлса, Данна. Анализ качественных признаков выполняли с использованием критерия ÷². Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

Участники исследования. Легкое течение АР отмечено у 15% больных, среднетяжелое – у 73,3%, тяжелое – у 11,7% (см. табл. 1).

При лабораторном обследовании у пациентов с аллергией к пыльце сорных трав определялись высокие уровни общего IgE, очень высокие уровни аллергенспецифических IgE к мажорному аллергену амброзии nAmb a 1, средние – к аллергенному компоненту полыни nArt v 1.

Медиана количества баллов по визуально-аналоговой шкале RTSS у пациентов, сенсибилизированных к пыльце сорняков, достигала 13 [10; 15] баллов.

При оценке эффективности АСИТ использовали шкалу А.Д. Адо [8]. В случае отсутствия симптомов поллиноза и потребности в лекарственной терапии в сезон пыления трав результат считали отличным, при возникновении легких симптомов, купирующихся на фоне симптоматических средств, – хорошим, при снижении интенсивности и длительности симптомов, но требующих приема лекарств более 2 раз в неделю, – удовлетворительным, при отсутствии эффекта от АСИТ или усилении симптомов – неудовлетворительным.

Отличных результатов после первого курса АСИТ удалось достичь у 5,8% больных, хороших и удовлетворительных – у 42,3 и 19,2% соответственно. После 2 лет АСИТ эффективность лечения составила 20,9; 37,2 и 18,6% соответственно. Суммарное количество баллов по шкале RTSS уменьшилось с 13 [10; 15] до 5 [4; 9] баллов после первого курса лечения и до 4,5 [3; 7, 5] – после второго.

Через год от начала АСИТ эффект отсутствовал у 32,7% пациентов, через 2 года – у 23,3%. Неэффективность двухлетнего курса АСИТ регистрировалась у 22,2% с олигосенсибилизацией к амброзии и полыни, у 28% – с полисенсибилизацией к пыльце трав и деревьев и только у 11,2% – с моносенсибилизацией к амброзии.

Нежелательные явления. Пациенты с системными реакциями в процессе АСИТ были исключены из исследования. У 17,3% пациентов, завершивших первый курс АСИТ, и у 13,9% – второй, возникали местные реакции, купировавшиеся самостоятельно или после приема пероральных антигистаминных средств.

Основные результаты. Уменьшение спонтанной реактивности базофилов после первого курса АСИТ регистрировалось в 36,5% проб, после второго курса их количество возрастало до 69,8% (табл. 2).

 

Таблица 2. Влияние АСИТ на показатели BAT у пациентов, сенсибилизированных к пыльце сорных трав

Показатели количество результатов / количество проб (%)	После 1-го курса АСИТ	После 2-го курса АСИТ
Снижение спонтанной активации базофилов	19/52 (36,5%)	30/43 (69,8%)
Снижение BAT после стимуляции аллергеном	58/86 (67,4%)	49/71 (69,0%)
Снижение ИС BAT после стимуляции аллергеном	43/86 (50,0%)	28/71 (39,4%)

 

У большинства пациентов в процессе мониторинга АСИТ выявлено уменьшение реактивности базофилов, стимулированных аллергеном. Снижение индуцированного BAT после первого курса АСИТ установлено в 67,4% проб, после второго курса – в 69%, ИС BAT – в 50 и 39,4% соответственно.

Мы проанализировали ИС BAT в зависимости от эффективности АСИТ. У 68,6% пациентов с положительным эффектом после 1-го курса АСИТ наблюдалось снижение ИС BAT (рис. 1).

 

Рис. 1. Снижение ИC BAT в зависимости от результата АСИТ; p – статистическая значимость различий по сравнению с группой «Отсутствие эффекта от АСИТ» (критерий ÷²)

 

У пациентов с отсутствием эффекта от лечения соответствующие показатели составили только 35,3%. При этом в 12 случаях снижение ИС BAT регистрировалось только в пробах с амброзией, в 2 – только с полынью, в 3 – только с тимофеевкой, в 7 – с амброзией и полынью, в 4 – с амброзией и тимофеевкой.

Среди пациентов, имевших положительный эффект после второго курса АСИТ, снижение ИС BAT отмечено в 57,6% случаев, при отсутствии эффекта – только в 20%.

В 5 случаях наблюдалось снижение ИС в пробах с амброзией, в 6 – только с полынью, в 3 – только с тимофеевкой, в 4 – с амброзией и полынью, в 1 – с амброзией и тимофеевкой.

Дополнительные результаты. При оценке медианы BAT выявлено снижение спонтанной активации базофилов через 15 мес от начала лечения (8,1 [6, 1; 11, 9] и 6 [4; 7, 4], p=0,04). После первого курса АСИТ статистически значимых различий не установлено (рис. 2).

 

Рис. 2. Динамика спонтанной реактивности базофилов у пациентов с сенсибилизацией к сорным травам, получавших АСИТ; * p<0,05, статистическая значимость различий по сравнению с показателями до лечения (критерий Ньюмена–Кейлса, Данна)

 

Показатели реактивности базофилов после провокации аллергенами амброзии (68 [46, 7; 81] и 49,1 [35, 5; 65, 2], p=0,01), полыни (52,1 [15, 9; 81, 9] и 32,8 [16; 54, 4]) и тимофеевки (46,4 [21, 7; 59] и 27,2 [13, 1; 36, 8]) существенно снижались у пациентов, получавших соответствующий вариант АСИТ, уже после первого курса лечения (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние АСИТ на стимулированную аллергеном реактивность базофилов пациентов, сенсибилизированных к сорным травам; * p<0,05, статистическая значимость различий по сравнению с показателями до лечения (критерий Ньюмена–Кейлса, Данна)

 

После второго курса лечения их уровни несколько возрастали (BAT Ambrosia – 57 [34; 67], p=0,01, BAT Artemisia – 33,2 [16, 3; 64, 5], BAT Phleum – 32 [11; 32]), однако не достигали значений до лечения. Статистически значимые различия получены только для BAT с аллергеном амброзии, что, вероятно, связано с небольшим объемом выборок пациентов, пролеченных аллергеном полыни и тимофеевки.

Индексы стимуляции базофилов (ИС BAT_стим./BAT_спонт.) имели те же закономерности. Так, ИС BAT Ambrosia до лечения составил 7,1 [3, 2; 13, 2], после первого курса АСИТ – 5,6 [2, 9; 7, 8], p=0,02, после второго – 6,9 [4, 1; 11, 5], ИС BAT Artemisia – 5,7 [2, 1; 11, 4], 4,5 [1, 84; 7, 35], 5 [2, 2; 11, 45], ИС BAT Phleum – 4,7 [2, 1; 10, 5], 3,4 [2, 26; 8, 7], 3,2 [2, 7; 3, 2] соответственно (рис. 4). Однако статистически значимых различий не получено.

 

Рис. 4. Влияние АСИТ на ИС BAT у пациентов с пыльцевой сенсибилизацией к сорным травам

 

Обсуждение

После двух курсов предсезонной АСИТ в 69,8% проб пациентов отмечается уменьшение спонтанной реактивности базофилов, в 69% – реактивности базофилов, индуцированной аллергеном. Снижение числа активированных клеток выявляется чаще у пациентов с положительными результатами АСИТ, что подтверждается при мониторинге BAT в 68,6% проб после первого курса АСИТ и в 57,6% – после второго.

Через 3 и 15 мес лечения под влиянием АСИТ наблюдается уменьшение величины медианы BAT в присутствии аллергена амброзии. Положительный эффект после первого курса АСИТ водно-солевыми аллергенами наблюдается у 67,3% пациентов, сенсибилизированных к пыльце сорных трав, после второго курса – у 76,7%, что сопровождается положительной динамикой клинических симптомов.

В ряде масштабных исследований показано, что определение ответа базофилов на аллергены является хорошим инструментом для мониторинга эффектов АСИТ [9, 10]. Установлено, что реактивность базофилов существенно снижается после АСИТ против аллергенов тимофеевки [11, 12], полыни [13], домашней пыли [9, 14].

Однако существует и другая точка зрения. В ряде работ не доказана информативность BAT как предиктора эффективности АСИТ аллергенами пыльцы трав [15], яда осы [16], домашней пыли [13]. Следует напомнить и известные данные, свидетельствующие о том, что десенсибилизация базофилов, вызванная обработкой клеток аллергеном, подавляет ответ базофилов быстро и неспецифически на стадии, предшествующей фосфорилированию p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase); базофилы идентифицировали как SSC^low CD193^bright, активированные базофилы – как СВ63⁺ клетки в популяции базофилов [17].

Ранее установлено, что АСИТ модулирует пороги активации базофилов и тучных клеток, снижая IgE-опосредованное высвобождение гистамина [5]. При этом АСИТ первоначально снижает активацию базофилов аллергеном с последующим уменьшением не только их количества, но и способности к продукции интерлейкинов-4 и -13 [14].

Снижение реактивности базофилов, а также истощение запасов медиаторов в результате повторяющейся стимуляции алллергеном становится ключевым механизмом на ранних стадиях АСИТ, поэтому BAT в ответ на аллерген in vitro представляется объективным маркером клинической толерантности, развивающейся в ходе АСИТ [9, 10].

Представленные данные носят предварительный характер, что связано с ограниченным объемом выборки пациентов, завершивших исследование, а также относительно коротким сроком наблюдения за ними. Применение нескольких концентраций аллергенов в реакции BAT в дальнейшем, а также сопоставление результатов BAT с другими биомаркерами (количество Тh2, содержание сывороточных антител к мажорным аллергенам сорных трав) позволит более точно оценить информативность BAT в качестве возможного предиктора эффективности АСИТ.

В заключение следует обратить внимание на свидетельства того, что тест активации базофилов является полезным инструментом не только для диагностики аллергических заболеваний [18, 19], но и для мониторинга индукции иммунной толерантности при АСИТ [11, 20]. Установлено, что раннее снижение реактивности базофилов может быть связано с клинической эффективностью АСИТ у пациентов, сенсибилизированных к луговым травам [21], пыльце кедрового дерева [22], аллергенам арахиса [18, 23, 24]. Правда, другие авторы не подтверждают эту закономерность [13, 15, 16].

В настоящем исследовании показано существенное уменьшение спонтанной реактивности базофилов после второго курса АСИТ у пациентов с моносенсибилизацией к амброзии и полисенсибилизацией к амброзии и другим пыльцевым аллергенам. Снижение активации базофилов после провокации аллергеном отмечается в 67,4% проб уже после первого курса АСИТ и в 69% – после второго. ИС BAT под влиянием АСИТ уменьшается преимущественно у пациентов с положительными результатами лечения. После первого и второго курсов АСИТ установлено уменьшение медианы BAT после стимуляции аллергеном амброзии. Полученные результаты позволяют предположить, что показатели ВАТ могут быть использованы в качестве перспективного предиктора эффективности АСИТ.

About the authors

Liudmila Yu. Barycheva

Stavropol State Medical University; Stavropol Regional Clinical Consulting and Diagnostic Center

Author for correspondence.
Email: for_ludmila@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-4069-0566
SPIN-code: 8946-3393

Head of the Department of Immunology
with a course of continuing professional education; allergist-immunologist, allergist-immunologist

Россия, Stavropol

Liudmila V Dushina

Stavropol State Medical University; Stavropol Regional Clinical Consulting and Diagnostic Center

Email: dushina.stv@gmail.com
SPIN-code: 3599-5095

Assistant of the Department of Immunology with a course of continuing professional education; doctor-laboratory assistant of the Laboratory Diagnostics Department

Россия, Stavropol

Marina V. Golubeva

Stavropol State Medical University

Email: mmvg@rambler.ru
SPIN-code: 7193-5101

Head of the Department of Pediatric Infectious Diseases, MD, PhD,
Professor

Россия, Stavropol

Milana M. Minasyan

Stavropol State Medical University

Email: m.milana84@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5823-7479
SPIN-code: 8518-5443

Assistant of the Department of Immunology with a course of continuing professional education, Candidate of Medicine, MD

Россия, Stavropol

Yulia N. Medvedenko

Stavropol State Medical University; Stavropol Regional Clinical Consulting and Diagnostic Center

Email: juliasun2008@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8276-7894
SPIN-code: 5602-6559

Assistant of the Department of Immunology with a course of continuing professional education; allergist-immunologist

Россия, Stavropol

References

Supplementary files