The study of sensitization in patients with allergic pathology to CWP2 protein Giardia intestinalis with varying lamblia seropositivity

Abstract

.

Full Text

В последние десятилетия во всем мире наблюдается значительный рост распространенности аллергических заболеваний среди всех возрастных групп населения. Участие Giardiaintestinalis в генезе аллергических заболеваний может быть обусловлено повреждением кишечной стенки, токсико - аллергическим воздействием продуктов обмена паразитов на макроорганизм, в результате чего отмечаются усиление проявлений атопии, гиперпродукция IgE и эозинофилия, а также развитие сенсибилизации к некоторым антигенным детерминантам [1]. Giardiaintestinalis (Giardialamblia, Giardiaduodenalis) является важным кишечным паразитом человека, относящимся к таксономической супергруппе «Excavates». 152 Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 Супергруппа «Excavata» объединяет одноклеточных организмов, принадлежащих к домену Eukaryota. Представители этой супергруппы впервые описаны исследователем Томасом Кавальером-Смитом в 2002 году, как новая филогенетическая категория, объединяющая множество свободноживущих и симбиотических форм простейших, включающих некоторых важнейших паразитов человека. Раньше считалось, что «Excavata» входят в устаревшее царство Protista (Простешие)[2]. В настоящее время Giardia intestinalis активно изучается, как в области эпидемиологии, так и в различных областях клинической медицины и эволюционной биологии. Эталонный протеом Giardia intestinalis получен из последовательности генома, изученного в рамках проекта «Геном Giardia lamblia», который был осуществлен под контролем Морской биологической лаборатории, Вудс-Хоул, Массачусетс, США. Геном имеет размер 11,7 Мб и содержит 6470 предсказанных кодирующих белок генов, распределенных по пяти хромосомам. В качестве одного из возможных механизмов вовлечения лямблий в реакции гиперчувствительности рассматривается потенцирование проникновения в кровь через кишечный барьер так называемых «необработанных белков» пищи и других метаболитов. В связи с этим целью настоящего исследования было выявление сенсибилизации к одному из белков протеома цистных форм лямблий (CWP2) и поиск перекрёстных эпитопов с аллергенами. Материалы и методы. В исследование включены лица с аллергическим ринитом, бронхиальной астмой, атопическим дерматитом и крапивницей, положительными прик- тестами с аллергенами и положительными результатами специфические суммарных антитела к антигенам лямблий, выявленных с использованием тест систем «Лямблия- антитела-ИФА-Бест, Лямблия IgM -ИФА-Бест «Вектор-Бест» Новосибирск. Тест системы выявляют специфические суммарные антитела (G, A, M), которые представлены по вкладу в оптическую плотность преимущественно классом IgG, а также антитела класса IgM. Биоинформационный анализ с целью определения B-клеточных эпитопов в аннотированном белке сystwallprotein 2 (CWP2) протеома лямблий проведен с помощью ресурса BepPred-2.0. Синтез и очистка пептидных эпитопов осуществлен компанией EzBiolab (США). Определение sIgE к линейным эпитопам проводили методом твердофазного ИФА. Подготовка сывороток крови. Сыворотки крови разводили 1:10 натрий фосфатным буферным раствором содержащим 1 % БСА. Синтезированные пептиды (эпитопы 1, 2, 3) наслаивали в лунки плоскодонного планшета Maxisorp ELISA (Nunc) в концентрации 120 мкг/лунку в объеме 100 мкл0,05 М натрий бикарбонатного буфера, рН 8,9, инкубировали в течение 12 часов при 4°C. Инкубировали со 100 мкл разведенной 1:10 исследуемой сыворотки в течение 1 часа. Использовали раствор коньюгата: anti-humanIgEmAb, в которых в качестве фермента использована щелочная фосфатаза в разведении 1: 3000 в натрий-фосфатном буфере, содержащим 1,0% БСА. Показатели считались положительными (наличие специфических sIgE), если ОП была равна или превышала пороговое значение, рассчитанное как среднее арифметическое трех отрицательных контролей плюс три стандартных отклонения (ОП ср+3SD). Статистический анализ. Применены методы параметрической статистики. Анализ и определение перекрестных эпитопов (гомологичных) с другими аллергенами осуществляли при помощи сервиса Allermatch™, который оперирует базой аминокислотных последовательностей более 450 аллергенных белков (AllergenDB_original_sequences database), представленных из различных биологических источников (растительные, животные, микрорганиз-мыи.т.д), многие из которых относятся к важнейшим пищевым, ингаляционнымымаллргенам [3]. Результаты. Положительные тесты н аналичие антител к лямблиям у больных с аллергопатологией со средними значениями коэффициента позитивности к лямблиям составили в среднем для суммарных антител 24,1 % (15,1-28,1) для антител класса IgM- 22,3% (11,128,5). Высокий и очень высокий уровень коэффициента позитивности к антигенам лямблий составил в среднем для суммарных антител- 10,8 % (3,1-20,0), для антител класса IgM -12,9 % (2,7-23,0). В периоды с максимальными уровнями выявляемости серопозитивных сывороток (2007;2011-12; 2017 гг) количество пациентов с низкими значениями уменьшалось (уровень суммарных антител соответственно до 49,5 % , p<0,05; уровень антител класса ^М до 46,2 %, p<0,05), в периоды с минимальными уровнями выявляемости серопозитивных сывороток напротив, количество пациентов с низкими значениями коэффициента позитивности увеличивалось (уровень суммарных антител до 68,6 %, p<0,05; уровень антител класса IgM до 70,7 %, p<0,05). Средние уровни коэффициента позитивности, как для суммарных антител, так и для антител класса IgM, распределялись равномерно по временному интервалу. При анализе уровня эпитоп-специфичных IgE антител к эпитопу 1 (30 DALDGANWKSNNWLTPDVSY49) и эпитопу 2 (224 NCPTTLERDGCTYYRQT 240) белкаCWP2, экспрессируемого при инцистировании вегетативных форм, установлено, что у пациентов со средними значениями коэффициента позитивности выявлены эпитоп-специфичные антитела к эпитопам этого белка в 56,0%, а при высоком и очень высоком уровне коэффициента позитивности к антигенам лямблий- в 89,0% случаев. При анализе эпитопной гомологии, изученных участков белка цистных форм лямблий с Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 153 другими аллергенами, при биоинформационном анализе установлена высокая степень гомологии (>80%) с эпитопами аллергокомпонентов пшеницы (глютеин), кукурузы (profilin-1), амброзии Ambrosia artemisiofolia (глутатион^-трансфераза), Candida albicans (энолоза), а средняя степень гомологии (>35%<80%) с Malassezia furfur (majorallergen Mal f1), Alternariaalternata (Alt a 1), сои (trypsininhibitor A). Таким образом, у пациентов с аллергопатологией выявлена корреляция выраженности иммунного ответа к лямблиям с уровнем и долей сенсибилизированных к эпитопным участкам белкаCWP2 цистных форм, а при биоинформационном анализе установлена высокая степень гомологии с эпитопами аллергокомпонентов пшеницы (глютеин), кукурузы (profilin-1), амброзии Ambrosia artemisiofolia (глутатион^-трансфераза) и Candida albicans (энолоза). Полученные данные демонстрируют вовлечение лямблий в реакции гиперчувствительности, точные механизмы которых требуют дальнейшего изучения. Что необходимо учитывать при ведении пациентов с аллергопатологией серопозитивных к Giardia intestinalis.