Funktsional'naya aktivnost' neytrofilov pri kolorektal'nom rake: immunologicheskie metody otsenki i prognosticheskie vozmozhnosti

Abstract

.

Full Text

Введение. Колоректальный рак (КРР) является логическими заболеваниями [1]. Небольшая доля КРР одним из наиболее распространённых злокачествен- характеризуется генетической предрасположенностью ных новообразований, занимающим третье место по (семейный аденоматозный полипоз, синдром Линча и смертности среди причин смерти, связанных с онко- другие редкие синдромы), в то время как основная часть 112 Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 случаев КРР - спорадические. К основным факторам патогенеза, вносящим вклад в развитие КРР, следует отнести хроническое воспаление. В частности, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК - болезнь Крона и язвенный колит) ассоциированы с повышенным риском развития вторичного КРР, прогностически менее благоприятного по сравнению со спорадическими случаями. При этом даже при спорадическом КРР без какой-либо связи с ВЗК, составляющем до 95 % случаев колоректального рака, хроническое воспаление, выраженное в опухолевом очаге, обеспечивает поддержание и прогрессирование опухолевого процесса [2]. Оценка активности воспаления у пациентов с КРР позволит найти перспективные прогностические и перспективные биомаркеры для оценки течения основного заболевания. Одним из способов клинико-лабораторной оценки активности воспалительного процесса является функциональное тестирование ней-трофилов. Нейтрофилы являются наиболее активными клетками, способными реагировать на малейшие изменения гомеостаза, и в числе первых отвечающими на стимуляцию чужеродными антигенами и воздействие повреждающих факторов [3]. Целью настоящей работы стало определение особенностей и прогностической ценности окислительного метаболизма и поверхностных маркеров нейтрофилов при КРР. Материалы и методы. Исследовали кровь 47 пациентов с КРР и 26 здоровых доноров. У пациентов с КРР выполняли ХЛ анализ и иммунофенотипирование нейтрофилов после операции с целью определения возможностей метода для раннего прогнозирования инфекционно-септических послеоперационных осложнений. Всем пациентам выполнялись полостные операции: колэктомии, гемиколэктомии, резекции прямой и сигмовидной кишок, гемигепатэктомии, резекции петель тонкой кишки; релапаротомии. Больным выполняли иммунологические тесты перед вмешательством (день 0), затем - после операции (дни +1, +2 и +3). Клинико-лабораторную оценку статуса больного проводили после +5 дня. Обследуемые пациенты причислялись к группе осложнённого течения после операционного периода при выполнении любых 2 критериев из трёх перечисленных, начиная с +5 дня после операции: 1) баллы SOFA (sepsis-related organ failure assessment score) > 5 или единовременное нарастание SOFA на 2+ балла; 2) температура тела > 38°С или лейкоцитоз > 15 тыс / мкл или СРБ > 100 мг / л ; 3) бактериологически подтверждённый очаг инфекции. Таким образом, из 47 обследованных пациентов наличием гнойно-септических послеоперационных осложнений характеризовались 12 человек. Окислительный метаболизм нейтрофилов оценивали методом хемилюминесцентного (ХЛ) анализа цельной крови; иммунофенотипирование нейтро-филов проводили методом проточной цитометрии. Фенотипирование включало определение уровня экспрессии Fc-рецепторов иммуноглобулинов (FcyRIII, CD16 и FcyRI, CD64) на основании оценки средней интенсивности флуоресценции в соответствующих каналах детекции. Для окрашивания использовали моноклональные антитела CD16-PE, CD64-FITC (BD). ХЛ анализ включал регистрацию ответа нейтрофилов, праймированных 50 нг/мл форбол-миристат-ацетатом (ФМА, Сигма), на внесение 10 мкМ N-формил-метио-нил-лейцил-фенилаланина (ФМЛФ, Sigma); в качестве ХЛ-зонда использован 45 мкМ люминол (Sigma). Для тонкого анализа кинетики наработки АФК фагоцитами в среде LabView (National Instruments, США) было разработано программное обеспечение позволяющее выполнять деконволюцию ХЛ-грамм объективным не зависящим от оператора способом. Процедура деконволюции позволяет раздельно анализировать параметры кинетических компонент результирующего ХЛ-ответа. ХЛ-граммы моделировали с помощью линейной комбинации степенных экспоненциальных функций, характеризующих вне- и внутриклеточную ХЛ. Оценивали интенсивности и светосуммы вне- и внутриклеточного ХЛ-ответа нейтрофилов. Результаты. При сравнении показателей ХЛ получены достоверные различия между группами пациентов с КРР перед хирургическим лечением и здоровых доноров. Соотношение светосумм вне- и внутриклеточной ХЛ Jf(t) / Jf(t) в контрольной группе составило - 4 'вне- - 4 'внутри- г rj 0,448 - 0,561 ед., в группе больных КРР - 0,694 - 1,07 ед (р < 0.001). Площадь под ROC-кривой для соотношения светосумм составила 0,763 (р < 0.0001), чувствительность лежит в диапазоне 0,67,3 - 0,91,8; специфичность -57,7 - 91,4 (p < 0,05). Соотношение интенсивностей вне- и внутриклеточной ХЛ Max f(t) / Max f(t) в вне- внутриконтрольной группе составило 1,31 - 1,88 ед., в группе больных КРР - 2,04 - 2,73 ед (р < 0.001). Площадь под ROC-кривой для соотношения интенсивностей составила 0,826 (р < 0.00001), чувствительность лежит в диапазоне 62,2 - 88,5 %; специфичность - 61,9 - 93,7 % (p < 0,05). Построена динамика экспрессии CD64 на мембранах нейтрофилов после хирургических вмешательств. Внутри группы пациентов с неосложнённым течением послеоперационного периода определяется незначительный подъём показателя с 0,440 - 0,799 ед. флуор. до 0,575 - 1,0 ед. флуор., в дальнейшем показатель остаётся на прежнем уровне. У пациентов с осложнённым послеоперационным периодом уровень экспрессии CD64 был повышен как перед операцией (1,01 - 1,25 ед. флуор., p < 0,05), так и на ранних сроках после неё (0,802 -1,63 ед. флуор., p < 0,001). На основании проведённого Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 113 ROC-анализа определено значение уровня экспрессии CD64 перед операцией и на 1-3 послеоперационные сутки, позволяющее отнести пациента в группу риска по развитию инфекционно-септических осложнений. К факторам риска следует отнести уровень экспрессии CD64 перед операцией выше 0,85 ед. флуор. (чувствительность 85,7 %, специфичность 77,8 %, p = 0,052) и выше 1,05 ед. флуор. в раннем послеоперационном периоде (чувствительность 70,4 %, специфичность 79,0 %, p < 0,001). Пациенты, отнесённые в группу риска по экспрессии CD64 характеризовались более длительными сроками пребывания в стационаре. Так, при повышении экспрессии CD64 выше порогового значения перед операцией медиана продолжительности госпитализации составляла 18 койко-дней, при нормальном уровне экспрессии - 9 койко-дней (p < 0,001). Повышение экспрессии CD64 в раннем послеоперационном периоде менее специфично, однако также ассоциировано с более длительным пребыванием больного в стационаре: медиана длительности госпитализации в группах с повышенным и нормальным CD64 составляет, соответственно, 13 и 10 койко-дней (p < 0,05). Согласно полученным данным, помимо увеличения экспрессии CD64, к факторам риска развития послеоперационных инфекционных осложнений следует отнести потерю экспрессии CD16. Среди больных с неосложнённым течением послеоперационного периода экспрессия маркера падает после вмешательства с 14.4 - 22,2 ед. флуор. до 9,77 - 18,5 ед. флуор., в дальнейшем показатель остаётся на прежнем уровне так же, как и в случае с CD64. У пациентов с осложнённым послеоперационным периодом уровень экспрессии CD16 в послеоперационном периоде составлял 5,1 - 10,0 ед. флуор., что достоверно ниже по сравнению с группой неосложнившихся больных (p = 0,001). Проведённый ROC-анализ определил пороговое значение уровня экспрессии CD16 в 1-3 послеоперационные сутки, позволяющее отнести пациента в группу риска по развитию гнойно-септических осложнений, составляющее 12,8 ед. флуор. Падение экспрессии маркера ниже указанного уровня ассоциировано с развитием инфекционных послеоперационных осложнений (чувствительность 87.5 %, специфичность 65,6 %, p = 0,002). Потеря экспрессии CD16 ассоциирована с более длительной госпитализацией пациентов: в группе с нормальным значением показателя медиана срока госпитализации составила 11 койко-дней; в группе с пониженным значением - 18 койко-дней (p < 0,01). Развитие инфекционных осложнений у обследованных пациентов ассоциировано с изменением окислительного метаболизма фагоцитов. Оценивали интенсивность внеклеточной наработки активных форм кислорода (АФК) как отношение максимума интенсивности соответствующего пика ХЛ (Max) к его полуширине (full width at half maximum, FWHM). При сопоставлении значений показателя в обследуемых группах было выявлено снижение интенсивности внеклеточной ХЛ в группе с осложнённым послеоперационным периодом на 2 - 3 сутки после вмешательства (p < 0,01): 2,25 - 3,06 • 10-3 по сравнению с 2,97 - 5,09 • 10-3 ед. Методом ROC-анализа вычислено пороговое значение интенсивности внеклеточной ХЛ, позволяющее отнести пациентов в группу риска развития гнойно-септических осложнений, составляющее 3,0 • 10-3 ед. Снижение интенсивности показателя ниже указанного уровня ассоциировано с развитием инфекционных послеоперационных осложнений (чувствительность 69,6 %, специфичность 68,5 %, p < 0,001). Снижение интенсивности внеклеточной ХЛ на 2 - 3 послеоперационные сутки ассоциировано с более длительной госпитализацией пациентов: в группе с нормальным значением показателя медиана срока госпитализации составила 10 койко-дней; в группе с пониженным значением - 19 койко-дней (p < 0,001). Заключение. В процессе исследования разработан и апробирован подход к оценке окислительного метаболизма и активации нейтрофилов периферической крови, основанный на методологии хемилюминесцентного анализа и проточной цитометрии. Показано, что развитие КРР ассоциировано с усилением внеклеточного ХЛ ответа. Построена динамика функциональных показателей нейтрофилов у пациентов с КРР в послеоперационном периоде и предложены клинически значимые индикаторы (CD16, CD64, интенсивность внеклеточной ХЛ), позволяющие прогнозировать инфекционно-септические осложнения у данных пациентов.