Development of neutrophilic bronchial asthma model in mice

Abstract

.

Full Text

Введение. Бронхиальная астма (БА) - это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризующееся обратимой бронхиальной обструкцией и гиперреактивностью бронхов. На сегодняшний день БА является наиболее распространенным во всем мире хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых [11]. У большинства больных БА происходит инфильтрация в ткань легких двух типов провоспалительных клеток: эозинофилов и нейтрофилов [6], с преобладанием тех или иных, что, в свою очередь, обуславливает различия в течении БА у больных. Эозинофильное воспаление преимущественно связано с легкой и умеренной БА, хотя наблюдается и при тяжелой неконтролируемой болезни, тогда как нейтрофильное воспаление происходит главным образом при более тяжелой форме БА [7]. Эозинофильная астма включает как аллергические, так и неаллергические эндотипы, в основе которых лежат иммунные реакции, опосредуемые цитокинами, продуцируемыми T-хелперами 2 типа (^2-клетками), тогда как нейтрофильная астма главным образом базируется на механизмах, опосредуемых Th1- и ^^-клетками [4]. Данные иммунновоспалительные профили развиваются вследствие функционального нарушения Т-регуляторных (Treg) лимфоцитов, что способствует активации дендритных клеток, которые направляют дифференцировку наивных Th0-клеток в те или иные подтипы Th-клеток. Нейтрофильный эндотип БА ассоциируется с агрессивным течением заболевания, выраженной деструкцией тканей и характеризуется низким ответом на стандартную терапию кортикостероидами [5, 9]. Все вышесказанное создает необходимость в создании новых лекарственных препаратов для терапии нейтрофильной астмы, для чего необходимо создание адекватных моделей данного заболевания на животных. В тоже время наиболее удобным видом для создания экспериментальных моделей являются мыши ввиду их не высокой стоимости, а также значительного разнообразия молекулярно-генетического инструментария [1, 2, 8, 10]. Поэтому целью работы было создание экспериментальной модели нейтрофильной БА у мышей. Материалы и методы. Экспериментальные данные были получены с использованием мышей-самок линии BALB/c весом 20-22 г, в возрасте 6-8 недель, полученных из питомника « Столбовая» ГУНЦ БМТ РАМН. При поступлении из питомника животные сначала были помещены в карантинную зону на 7 дней, в течение которых проводили ежедневное обследование состояния животных. При формировании экспериментальных групп в качестве критерия отбора использовали показатель массы тела так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения более чем на 10%. Мыши были разделены на 4 группы. Группу 1 иммунизировали внутрибрюшинно (в/б) 20 мкг/мышь овальбумина куриного яйца (OVA), эмульгированного 108 Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 в Al(OH)3, 3 раза с 2-недельными интервалами. Группа 2 была иммунизирована в/б OVA вместе с адъювантом Фрейнда (FA). В дни эксперимента 42-44 обе группы были помещены в ингаляционные камеры для провокации аллергического воспаления модельным аллергеном OVA. Группа 3 была иммунизирована внутрибрюшин-но OVA в комплексе с FA. В дни 42-44 у этих мышей проводили провокацию смесью OVA и липополисаха-рида (LPS), полученного из E.coli. Мышей в группе 4 иммунизировали и провоцировали натрий-фосфатным буфером (PBS). Через 24 часа после провокации измеряли гиперреактивность дыхательных путей с помощью неинвазивной плетизмографии. Образцы сыворотки крови были взяты из ретроорбитального синуса анестезированных мышей. Далее с помощью ИФА были определены уровни сывороточных анти-OVA специфических IgE-, IgG1- и IgG2a-антител. Через 48 часов после провокации собирали бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) для дифференциального подсчета лейкоцитов методом световой микроскопии. В клетках БАЛ, при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-time PCR), определяли экспрессию генов, отвечающих за различные иммунновоспалительные профили. Результаты. Все 3 группы, иммунизированные аллергеном, продемонстрировали высокий уровень антител в сыворотке по сравнению с интактными мышами. Уровень IgG1 у мышей, иммунизированных смесью OVA и FA, был выше, чем у мышей, иммунизированных смесью OVA и гидроксида алюминия. Было показано, что все 3 экспериментальные группы, которые получали OVA, демонстрировали на 30% более высокий уровень гиперреактивности бронхов (ГРБ) в ответ на вдыхание возрастающих концентраций метахолина по сравнению с контрольной группой. Повышение ГРБ у этих групп мышей можно объяснить тем фактом, что оба протокола иммунизации OVA обеспечивают одинаково высокие уровни специфических антител IgE, которые являются одним из ключевых медиаторов развития гиперреактивности дыхательных путей у больных астмой. Анализ клеточного состава БАЛ показал преимущественную инфильтрацию легких эо-зинофилами после иммунизации смесью OVA и гидроксида алюминия (около 45 000±2 000 кл/мл). У мышей, иммунизированных смесью OVA и FA с последующей провокацией исключительно OVA, наблюдалось повышение уровня нейтрофилов (около 4 000±500 кл/мл) и снижение количества эозинофилов до 7 000±500 кл/мл клеток. Наибольшее количество нейтрофилов в БАЛ было обнаружено у мышей, провоцированных смесью OVA и LPS (40 000±2 000 кл/мл), при этом эозинофилы в БАЛ не выявлялись. Гистологический анализ тканей легких подтвердил данные, полученные при подсчете клеточного состава БАЛ; наиболее выраженная инфильтрация легких нейтрофилами наблюдалась у мышей, получавших аэрозольную провокацию смесью OVA и LPS. В то же время у мышей, иммунизированных смесью OVA и гидроксида алюминия, наблюдалась инфильтрация легких эозинофилами. Кроме того, гистологический анализ выявил повышенную метаплазию и гиперплазию эпителиальных клеток бронхов во всех трех экспериментальных группах. Таким образом, проведенный эксперимент показал заметную инфильтрацию легких нейтрофилами в группе мышей №3, которых иммунизировали смесью OVA и FA с последующей провокацией смесью OVA и LPS. Чтобы установить преобладающий тип иммунного ответа, мы проанализировали экспрессию цитокинов в клетках БАЛ, взятых от этих мышей, с использованием метода Real-time PCR. Проведенный анализ выявил 3,5-кратное повышение уровня экспрессии гена интерлейкина-4 (IL-4) - маркера ^2-имунного ответа и 7,5-кратное повышение уровня экспрессии гена интерферона-g (IFN-g) - маркера Th1-имунного ответа, по сравнению с контрольной группой №4. В то же время уровень экспрессии IL-17F (маркер Th^-им-мунного ответа) был увеличен в 10 раз, по сравнению с контрольной группой. Эти данные указывают на более существенную поляризацию иммунного ответа по направлению к ^^-типу в группе с LPS. Заключение. Таким образом, можно сделать вывод, что иммунизация мышей специфическим аллергеном вместе с адъювантом Фрейнда и с последующим аэрозольным введением того же аллергена в смеси с LPS приводит к развитию экспериментальных признаков БА с нейтрофильным эндотипом: наличие специфических антител IgE, IgG1, IgG2a в сыворотке, увеличение ГРБ на 30%, увеличенное накопление нейтрофилов в легких. Анализ уровней экспрессии маркерных генов показал, что вышеуказанные признаки нейтрофильной БА у мышей развиваются посредством ^^-зависи-мого механизма, что сходно с клинической картиной, наблюдаемой у человека. Созданная модель может быть использована как для тестирования новых про-тивоастматических препаратов [3], так и для изучения молекулярных механизмов патологии.