Activation of blood cells by LPS and DpE: the role of sMD-2 and p38 MAPK in the development of allergic inflammation

Abstract

.

Full Text

Аэроаллергия является результатом неадекватного иммунного ответа на чужеродные антигены. В связи с глобальным распространением аллергической астмы повышенное внимание уделяется механизму развития аллергического ответа и усиливающим этот эффект молекулам. Распространенная причина развития аллергической реакции - белки клещей рода Dermatophagoides, содержащиеся в домашней пыли, эффект белков-аллергенов часто усиливается ЛПС, содержащимися в среде обитания клещей. Основной аллерген клеща D. pteronyssinus, белок Der р 2, является структурным и функциональным гомологом белка крови человека -MD-2 [1]. MD-2 - корецепторная молекула TLR4, необходимая для распознавания эндотоксина, доставленного транспортными белками (LBP, sCD14) [2]. Der p 2 так же усиливает экспрессию РНК MD-2 и синтез самого белка [3, 4], может напрямую взаимодействовать с TLR4, восстанавливая ЛПС-управляемую сигнализацию в отсутствие MD-2 [5]. Избыточно наработанный MD-2 секретируется в кровь в виде растворимой формы (sMD-2) [6], обеспечивая доставку ЛПС к эффекторным клеткам. sMD-2 также способен создавать внеклеточные комплексы со свободным TLR4 на поверхности клеток, усиливая ответ на ЛПС [7]. MAPK, участвующие в цепях передачи внутриклеточного сигнала от TLR4, представляют группу белков, включающих три небольших семейства - p38 MAPK, JNK/SAPK и ERK. Основными мишенями MAPK являются транскрипционные факторы. Ответ клеток на Der p 2 включает активацию MAPK и NF-kB, и эти пути передачи сигнала по-разному регулируют синтез медиаторов воспаления [8]. В настоящее время не известно, насколько полным функциональным гомологом белка sMD-2 является аллерген Der p 2, как взаимодействуют эти белки непосредственно в крови, происходит ли активация клеток врожденного иммунитета комплексами ЛПС•MD-2 или ЛПС•Der p 2 по одному и тому же сигнальному пути, индуцированному TLR4. Цель исследования: определение роли sMD-2 и p38 MAPK в активации клеток крови ЛПС из Escherichia coli O55:B5 и собственно экстрактом аллергенов из D. pteronyssinus (DpE). Материалы и методы исследования. В работе использовали S-гликоформу ЛПС E. coli O55:B5 («Sigma-Aldrich», USA); экстракт аллергенов из клеща D. pteronyssinus - DpE (1000 PNU/ml, АО БИОМЕД), anti-MD2 антитела (Abcam), среду RPMI1640, содержавшую 25 мМ HEPES, NaHCO3 и L-глутамин (Sigma), раствор Дульбекко (0,137 М NaCl; 2,68 мМ KCl; 8,06 мМ Na2HPO4x12 H2O; 1,47 мМ KH2PO4), SB 203580 ингибитор р38 МАРК («Sigma-Aldrich», USA), иммуно-ферментные тест-системы для определения цитокинов TNF-a и IL-8 (ООО «Цитокин»). Периферическую кровь условно здоровых добровольцев обоих полов (25-30 лет) получали в клинических условиях (БПНЦ РАН) по информированному согласию на проведение исследований. Определение содержания цитокинов в образцах проводили с помо щью иммуноферментных наборов по методикам, предложенным производителями. Результаты представлены в виде медианных значений с квартилями (IQR). Достоверность различий между медианными значениями оценивали с помощью U-теста Манна-Уитни и критерия знаков Вилкоксона. Влияние блокирования белка MD-2/sMD-2 на синтез TNF-a и IL-8 в ответ на аллерген и эндотоксины. Для оценки провоспалительного ответа образцы крови инкубировали с эндотоксином и/или DpE в течение 6 ч. При исследовании эффекта блокирования MD-2/sMD-2 образцы инкубировали сначала 30 минут при комнатной температуре с блокирующими антителами, а затем 6 ч с агонистами. Вклад p38 MAPK в активацию лейкоцитов цельной крови к продукции цитокинов. Гепаринизированную кровь (концентрация гепарина 5%) разводили средой RPMI1640 в соотношении 1:4 и разносили по 1 мл в 24-луночные планшеты «Cellstar» («Greiner bio-one», Germany). Часть образцов крови предварительно инкубировали с ингибитором р38 MAP-киназы SB203580 (10 мкМ) в течение 15 мин [9]. К образцам цельной крови добавляли ЛПС E. coli (40 нг/мл) и/или DpE (1000 PNU/ml). Образцы инкубировали в течение 6 ч в СО2-инкубаторе («Jouan», France) при 37° С и 5%-ном содержании СО2. После инкубации клетки крови осаждали центрифугированием при 300 g (10 мин). Полученные супернатанты отбирали и хранили при -20° С до определения содержания цитокинов. Результаты. Влияние блокирования белка MD-2/sMD-2 на синтез TNF-a и IL-8 в ответ на аллерген и эндотоксины. Активация клеток крови DpE не влияла на уровень провоспалительных цитокинов в крови. Блокирование белка MD-2/sMD-2 также не влияло на количество TNF-a и IL-8 при действии аллергена. Активация клеток крови эндотоксином и комбинацией эндотоксина и аллергена достоверно увеличивала количество секретируемых провоспалительных цитокинов. При блокировании белка MD-2/sMD-2 синтез TNF-a клетками крови в ответ на комбинацию аллергена и ЛПС снижался примерно на 7%. С заблокированным белком MD-2/sMD-2 клетки активнее нарабатывали провоспа-лительный цитокин по сравнению с активацией только эндотоксинами. Количество нарабатываемого клетками крови хемо-кина IL-8 при одновременной активации аллергеном и ЛПС E. coli достоверно не изменялось по сравнению с активацией только ЛПС. Блокирование белка MD-2/ sMD-2 не влияло на наработку хемокина клетками крови в ответ на комбинацию эндотоксина и аллергена. Вклад p38 MAPK в активацию лейкоцитов цельной крови к продукции цитокинов. 82 Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 Блокирование р38 MAPK снижало синтез TNF-a, индуцированный ЛПС E. coli (на 32% (p<0,05)) и практически полностью ингибировало эффект DpE (p<0,001). Сочетанное действие DpE и ЛПС E. coli снижало эффективность SB203580, продукция TNF-a подавлялась на 23% (p<0,05). Ингибирование р38 MAP-киназы не влияло на продукцию клетками крови IL-8 во всех вариантах эксперимента. Обсуждение. Нами показано, что при одновременной активации клеток крови эндотоксином и экстрактом аллергена клеща домашней пыли усиливается синтез TNF-a и IL-8. Мы предположили, что данный результат связан с увеличением количества растворимой формы белка MD-2 в крови, приводящей к более эффективной доставке ЛПС к TLR4-несущим клеткам [4]. Исследования показали, что блокирование MD-2 и sMD-2 с помощью антител снижает уровень нарабатываемого провоспалительного цитокина TNF-a в ответ на комбинацию ЛПС E. coli и DpE. Количество синтезируемых цитокинов в ответ на комбинацию ЛПС E. coli и аллергена при блокировании MD-2/sMD-2 остаётся выше, чем при активации клеток только эндотоксином. Таким образом, Der p 2 усиливает ответ на ЛПС E. coli в цельной крови человека по двум механизмам: активируя синтез дополнительного sMD-2 с одной стороны, и за счёт собственной функциональной гомологии с этим белком - с другой. Это позволяет ему обеспечивать доставку ЛПС E. coli к клеткам и взаимодействовать с TLR4 в отсутствие MD-2/sMD-2. Данные in vitro свидетельствуют о том, что помимо p38 MAPK ЛПС-индуцированный синтез TNF-a запускается при участии других путей сигнализации, например, членов семейства MAPK p42/44, c-Jun N-концевой киназы и пути NF-kB [11]. Проведенные нами исследования показали, что при активации клеток цельной крови DpE и/или ЛПС E. coli, роль киназы p38 MAPK в продукции TNF-a является значимой, т.к. в каждом варианте опыта ингибирование продукции этого цитокина было достоверным. Другая картина наблюдается в синтезе хемокина IL- 8. Одновременная активация аллергеном и эндотоксином не приводит к изменению уровня нарабатываемого IL-8 по сравнению с активацией только ЛПС E. coli. Блокирование MD-2/sMD-2 не влияет на синтез этого хемокина клетками крови в ответ на комбинированное действие аллергена и ЛПС E. coli. Наблюдаемое различие в синтезе TNF-a и IL-8 может быть связано с различными внутриклеточными путями активации синтеза этих цитокинов. При ингибировании p38 MAPK в клетках цельной крови не происходит достоверных изменений уровня ИЛ-8 в случае активации ЛПС E.coli и/или DpE. Это свидетельствует о том, что при использовании ЛПС E.coli и/или DpE в качестве активирующих агентов синтез цитокина, вероятно, в меньшей степени зависит от активации MAPK-сигнального пути. Ngkelo и др. выяснили, что стимуляция РВМС человека с помощью ЛПС, приводящая к высвобождению провоспалитель-ных цитокинов, таких как CXCL8 и IL-6, частично зависит от сигнализации PI3K [11]. Выводы. Полученные нами результаты демонстрируют значимость sMD-2 в одновременной активации клеток крови ЛПС E.coli и DpE. Собственно белок Der p 2 является функциональным гомологом белка sMD- 2, способным действовать как синергетически с этим белком, так и выполнять его функции транспорта ЛПС E.coli к рецептору TLR4. Это приводит к активации клеток врожденного и приобретённого иммунитета и синтезу провоспалительного цитокина TNF-a. Вклад сигнального пути p38 MAPK в активацию синтеза TNF-a клетками цельной крови снижается при применении ЛПС E.coli совместно с DpE. Синтез IL-8 клетками крови в ответ на ЛПС E.coli и ЛПС E.coli + DpE преимущественно осуществляется при участии сигнального пути, не вовлекающего p38 MAPK (вероятно, PI3K).