Polymorphic gene tlr2 markers in latent syphilis and seroresistance

Abstract

.

Full Text

Важным направлением современной медицины является поиск информативных биомаркеров персисти-рующих инфекций, которые могут использоваться для оценки потенциального риска развития заболевания и реализации его клинических фенотипов [1, 2]. Исследования последних лет показали, что полиморфизмы генов рецепторов врожденного иммунитета (TLR) ассоциированы с развитием грамположительных инфекций, туберкулеза [3], инфекционного эндокардита [5], сепсиса [4]. Установлено, что ключевое значение среди полиморфизмов, влияющих на функции TLR имеют однонуклеотидные мутации (SNP) в областях, ответственных за внешний (LRR) и внутренний (TIR) домены рецепторов, трансформация структуры и функции которых обуславливает дефекты проведения сигнала внутрь клетки [1, 2]. Известно, что нарушение экспрессии и функции TLR проявляется в снижении продукции цитокинов, определяющих интенсивность реакций врожденного и адаптивного иммунитета и способствует развитию персистирующей инфекции [1, 2]. Цель исследования. Изучение генного полиморфизма рецептора врожденного иммунитета - TLR2 Arg753Gln (rs5743708) у пациентов с серорезистентным, ранним и поздним скрытым сифилисом. Материал и методы. Иммуногенетические исследования выполнены у 100 человек с сифилитической инфекцией, находившихся под наблюдением в Краевом клиническом кожно-венерологическом диспансере. В группу I вошли 35 пациентов с ранним скрытым сифилисом, в группу II - 24 пациента с поздним скрытым сифилисом, в группу III - 41 пациент с серорезистентным сифилисом. Контрольную группу составили 50 здоровых жителей русской популяции Южного региона России, сопоставимых по возрасту и полу. Типирование SNPs TLR2 TLR6 осуществляли методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с выполнением амплификации интересующего участка и последующей обработкой эндонуклеазой рестрикции. В работе использовали диагностические наборы для выявления полиморфизмов в геноме человека методом полимеразной цепной реакции «SNP-экспресс» ООО НПФ «Литех», г. Москва. Амплификацию проводили с помощью многоканального амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия). Разделение продуктов амплификации выполняли в 3% агарозном геле методом горизонтального электрофореза с использованием комплекта оборудования «BioRad Laboratories», США. Иммунофенотипирование лимфоцитов осуществляли методом проточной цитометрии с использованием одно- и двухпараметрических реагентов линии IQTest: CD19-PC5, HLA-DR-PC5, CD3-FITC/CD4-PЕ, Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 23 CD8-PC5, CD3-FITC/CD (16+56)-PE, CD45-ECD фирмы Beckman Coulter, США на лазерном проточном цитометре Cytomicx FC 500 фирмы Beckman Coulter, США. Общее количество лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов определяли с использованием одноплатформенной технологии с помощью гетерогенного гейтирования по панлейкоцитарному маркеру CD45+ и показателям светорассеяния с применением калибровочных частиц Flow-Count Fluorospheres фирмы Beckman Coulter, США. Для статистического анализа данных использовали пакет программ «Attestat 10.5.1.», «Калькулятор для расчета статистики» (http://www.gen-expert.ru). Достоверность различий в частотах аллельных вариантов и генотипов оценивалась с помощью критерия %2 Пирсона. Степень риска развития событий оценивали по величине отношения шансов (OR) с расчетом доверительного интервала CI. Результаты и обсуждение. При оценке распределения аллелей полиморфизма 753 Arg /Gln (rs5743708) отмечено преимущественное нахождение дикого аллеля Arg/ в гомозиготном состоянии, как у пациентов с сифилисом (71%), так и у здоровых доноров (96%). При этом установлено существенное увеличение частоты встречаемости редкого аллеля Gln/753 у пациентов с сифилисом 78/200 (0,39) (OR=20,7, CI:6,33-67,6). Следует отметить, что гомозиготное состояние минорного аллеля Gln/753 в группе больных сифилисом встречалось в 10 раз чаще, чем у здоровых доноров (0,21 и 0,02, p<0,01). При расчете показателей отношения шансов наблюдалось существенное увеличение риска развития сифилиса у носителей гомозиготного Gln/Gln (OR=13,0, CI:1,70-90,0) и гетерозиготного Arg/Gln (OR=4,26, CI:0,52-35,1) генотипов. При анализе отдельных клинических форм установлено достоверное уменьшение частоты мажорного аллеля (Arg/753) и увеличение распространенности мутантного аллеля (Gln/753), как при серорезистентном, так и при скрытых формах сифилиса. Риск развития заболевания у резидентов Gln/753 при раннем скрытом сифилисе составил 8,1 (CI: 2,23-29,4), при позднем скрытом - 7,46 (CI: 1,92-23,0), при серорезистентном - увеличивался в десятки раз - 65,8 (CI: 19,1-227,1) У больных всех групп выявлено уменьшение частоты встречаемости гомозиготного генотипа по доминантному аллелю (Arg/Arg). При этом только в группе с серорезистентным сифилисом определялось достоверное увеличение распространенности гомозиготного варианта генотипа по редкому аллелю (Gln/Gln). Относительный риск развития заболевания у резидентов гомозиготного генотипа полиморфизма TLR2 -753 Arg/Arg (rs5743708) был крайне низким. У носителей гетерозиготного генотипа Arg/Gln при раннем скрытом сифилисе составил 2,97 (CI: 0,26-34,1), при позднем скрытом - 2,13 (95% CI: 0,13-35,6), при серорезистентном - 6,81 (95% CI: 0,76-60,8). Наиболее высокой оказалась вероятность развития сифилитического процесса у гомозигот по мутантному аллелю Gln/Gln. При раннем скрытом сифилисе показатель отношения шансов равнялся 10,2 (95% CI: 1,16-88,5), при позднем скрытом - OR=9,8 (95% CI: 1,03-93,2), при серорезистентном - OR=17,9 (95% CI: 1,21-146,3). Учитывая значительную роль рецепторов врожденного иммунитета TLR2 в индукции иммунного ответа, в работе проведено сопоставление показателей иммунофенотипирования Т-лимфоцитов, Т-хелпе-ров, Т-цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров у пациентов с сифилисом в зависимости от вариантов генотипов TLR2 (Arg753Gln). Не выявлено достоверных отличий содержания общих Т-лимфоци-тов и Т-цитотоксических лимфоцитов у пациентов с различными генотипами TLR2-753Arg/Gln (rs5743708) в отличие от здоровых доноров. Установлено снижение абсолютных показателей Т-хелперов - 0,80 (0,67-0,92), p<0,05 и NK-клеток - 0,21 (0,17-0,25), p<0,05 у пациентов с сифилисом, имеющих гомозиготный генотип TLR2 -753 Gln/Gln (rs5743708) по сравнению со здоровыми респондентами. Известно, что TLR2 распознает большое число микробных паттернов, в том числе пептидогликаны, липотейхоевые кислоты, липопротеины, липопетиды, гликоинозитол-фосфолипиды, гликолипиды, атипичные липополисахариды, фенолрастворимый модулин. Замена дикого аллеля G (rs5743708) на мутантный А приводит к нарушениям при гетеродимеризации с TLR6 с последующим уменьшением активности внутриклеточных сигнальных путей [6]. Минорный аллель А ассоциирован со снижением активации ядерного фактора NF-kB и уменьшением числа иммунокомпе-тентных клеток и повышенной чувствительностью к бактериальным патогенам [6]. В случае SNP 753 Gln/ Gln дефицит продукции IL-12 и IL-2 может способствовать снижению дифференцировки и уменьшению количества Th1 и NK-клеток [7, 8]. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о том, что нарушение функции TLR2 наблюдается преимущественно у обладателей гомозиготного варианта полиморфизма TLR2 A2258A [7, 9]. Заключение. Таким образом, можно предполагать, что носительство минорного аллеля Gln/753, а также гетерозиготного (Arg/Gln) и гомозиготного (Gln/Gln) по редкому аллелю генотипов обладают предиктивными свойствами в отношении развития сифилитической инфекции. Наиболее высокая степень ассоциации 24 Российский Аллергологический ^^урнал 2019 том 16 № 1 генотипов 753 Arg/Gln и 753 Gln/Gln определяется с развитием серорезистентного сифилиса. Низкие показатели содержания Т-хелперов и натуральных киллеров у больных скрытым сифилисом и пациентов с серорезистентностью ассоциированы с генотипами TLR2-753 Gln/Gln.