Effect of home dust mite allergen der p on production of cytokines by peripheral blood mononuclear cells in healthy donors and asthmatic patients

Abstract

Full Text

В настоящее время одной из актуальных проблем фундаментальной и клинической иммунологии является изучение механизмов врожденного иммунитета. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета, являются TLR, распознающие лиганды эндо - и экзогенного происхождения [1, 7]. Нарушения экспрессии и функциональной активности TLR могут приводить к развитию тяжелых иммунопатологий, способствовать развитию многих заболева ний, таких как атеросклероз, сепсис, ревматоидный артрит, инфаркт миокарда, аллергические заболевания [8]. Недавно было установлено, что TLR4 принимает участие в распознавании бытовых аллергенов, в частности аллергена клещей домашней пыли. Аллергены клещей домашней пыли являются одними из основных аллергенов, вызывающих наиболее часто встречающиеся аллергические заболевания, в частности бронхиальную астму и аллергический 112 Р оссийский Аллергический Журнал Влияние аллергена клещей домашней пыли Der p на выработку цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров и больных бронхиальной астмой ринит [2, 6]. В домашней пыли обнаруживают более 50 видов клещей, из которых основную долю составляют Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae. Выделяют более 30 групп аллергенов, выделенных из клещей домашней пыли, из которых ключевое значение отводят Der p1, Der p2 и Dep p 23 [6]. Считается, что Der p2 может воспроизводить функцию MD2, участвовать в формировании комплекса ЛПС с TLR4 и запускать активацию рецептора. Кроме того, аллергены клещей домашней пыли часто контаминированы липополисахаридом - основным лигандом TLR4, что также может приводить к вовлечению TLR4, выработке ци - токинов, которые направляют адаптивный иммунный ответ по Th2 типу [3, 5]. Таким образом, несмотря на то, что в развитии аллергических заболеваний основную роль отводят адаптивному иммунитету, согласно последним данным, существенный вклад в поддержание воспаления вносят механизмы врожденного иммунитета. Целью данного исследования является определение влияния аллергена клещей домашней пыли Der p и комбинации Der p c ЛПС на выработку ФНОа, ИЛ - 4 и ИЛ - 13 мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови больных БА и здоровых доноров. Материалы и методы Группу обследуемых составили 16 больных атопической бронхиальной астмой средней степени тяжести с сенсибилизацией к бытовым аллергенам в возрасте 18 - 45 лет. Все обследуемые наблюдались в отделении иммунопатологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Диагноз устанавливался в соответствии с критериями GINA (2016). Критериями включения в исследование являлся установленный диагноз бронхиальной астмы, отказ от приема системных глюкокорстикостероидов минимум за 4 недели до забора крови для проведения исследования, отсутствие хронических заболеваний в анамнезе. Контрольную группу составили 20 здоровых доноров в возрасте от 18 до 47 лет. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной периферической крови (25 ед/1 мл крови) здоровых доноров и больных БА в одноступенчатом градиенте плотности фиколл - урографина (1,077 г/см3). Полученные клетки культивировали в среде PRMI - 1640 (HyClone) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma), 100 мкг/мл гента - мицина и 2 mML - глутамина (Sigma) в течение 24 часов в СО2 - инкубаторе. Рабочая концентрация клеток составила 1*106 в мл. В качестве лигандов TLR использовали ЛПС (E.Coli 0111: B4, Sigma) в дозе 0,1 мкг/мл и аллерген из клеща Dermatophagoides pteronissinus для диагностики и лечения («Биомед им. Н.И. Мечникова», Россия) в дозе 10 мкг/мл и 1 мкг/мл, а также комбинацию ЛПС и Der p (10 мкг/мл и 1 мкг/мл). Концентрацию ФНОа, ИЛ - 4, ИЛ - 13 в супернатантах МНК определяли с помощью иммуноферментного анализа (использовали коммерческие наборы фирмы «e - Biosciences»). При обработке результатов пользовались программным обеспечением STATISTICA 6.0. Данные выражали в виде медианы (Ме) и 25 - 75 перцентилей. Для оценки статистической значимости использовали непараметрический критерий Манна - Уитни. Уровень достоверности считали значимым при p<0,05. Результаты и обсуждение. На первом этапе работы определяли спонтанный уровень продукции исследуемых цито - кинов МНК периферической крови здоровых доноров. В результате проведенного исследования, было установлено, что в группе здоровых доноров уровень спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови составил 118 (64,0186,75) пг/мл, ИЛ - 4 - 19,57 (17,5 - 21,9) пг/мл, а ИЛ - 13 - 7,96 (6,36 - 8,5) пг/мл. Культивирование МНК периферической крови здоровых доноров в присутствии Der p в дозе 10 мкг/мл и 1 мкг/мл приводит к статистически достоверному увеличению концентрации ФНОа в супернатантах культивируемых клеток (411,15 (408,91 - 570,92) и 447,53 (429,91 - 474,05) пг/мл, соответственно). Уровни ИЛ - 4 и ИЛ - 13 после стимуляции МНК Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл были сопоставимы со спонтанной продукцией цитокинов клетками, составили 18,7 (16,9621,92) и 24,50 (22,35 - 26,43) пг/мл для ИЛ - 4; 6,71 (6,25 - 8,75) и 4,60 (3,85 - 4,98) пг/мл для ИЛ - 13. Таким образом, было выявлено, что у здоровых доноров выработка ФНОа МНК периферической крови после стимуляции Der p увеличивалась более чем в 3 раза по сравнению с показателем спонтанной Р оссийский.^Аллергический ^Журнал 113 Хорева М.В., Латышева Т.В, Огурцова А.Д., Грачева Л.А., Бологов А.А., Захаров М.В., Федоскова Т.Г., Юдин А.А. выработки цитокина. Доза Der p существенно не влияла на продукцию ФНОа МНК периферической крови. Не было выявлено изменения уровня продукции ИЛ - 4 и ИЛ - 13 МНК периферической крови здоровых доноров при стимуляции Der p по сравнению со спонтанной продукцией цитокинов. У больных БА с сенсибилизацией к бытовым аллергенам спонтанная продукция ФНОа МНК периферической крови составила 481,76 (476,88 - 521,42) пг/мл, ИЛ - 4 - 26,22 (18,48 - 33,07) пг/мл, а ИЛ - 13 - 6,71 (5,917,13), пг/мл. Уровень Der p - индуцированной (Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл) продукции ФНОа МНК периферической крови у больных БА статистически достоверно выше, чем у здоровых доноров (1270,13 (1101,361335,21) пг/мл и 1145,0 пг/мл (925,25 - 1343,81), соответственно). В группе пациентов с БА в су - пернатантах МНК, культивируемых в присутствии Der p в исследуемых концентрациях, уровень ИЛ - 4 составил 23,64 (22,78 - 24,50) и 28,79 (26,22 - 35,64) пг/мл, а абсолютные значения ИЛ - 13 - 6,39 (5,89 - 6,63) и 6,39 (5,64 - 7,38) пг/мл, соответственно. Таким образом, было выявлено, что стимуляция МНК периферической крови больных БА Der p в исследуемых концентрациях не приводит к достоверному изменению выработки ИЛ - 4 и ИЛ - 13 по сравнению с контролем. В дальнейшем мы оценивали влияние Der p (10 мкг/мл и 1 мкг/мл) в сочетании с ЛПС (0,1 мкг/мл) на выработку ФНОа, ИЛ - 4 и ИЛ - 13 МНК периферической крови здоровых доноров и больных БА. В группе здоровых доноров абсолютные значения ФНОа составили - 576,5 (430,5 - 805,5) и 763,23 (621,45 - 837,81) пг/мл; ИЛ - 4 - 18,7 (16,24 - 20,45) и 22,35 (21,49 - 23,64) пг/мл; ИЛ - 13 - 6,88 (5,29 - 7,75) и 5,35 (4,98 - 6,10) пг/мл, соответственно. Совместное действие Der p и ЛПС на МНК периферической крови больных БА приводит к увеличению продукции ФНОа (1330,00 (1266,25 - 1482,58) и 1337,76 (1214,931520,54) пг/мл, соответственно) по сравнению со значениями в группе здоровых доноров, но не влияет на выработку ИЛ - 4 (23,64 (19,3424,50) и 22,78 (21,92 - 25,36) пг/мл) и ИЛ - 13 (6,64 (6,39 - 7,38) и 7,88 (6,89 - 8,87) пг/мл) соответственно. В группе здоровых доноров и больных БА наблюдалось увеличение выработки ФНОа в ответ на комбинацию Der p c ЛПС по сравнению с показателями, полученными после стимуляции МНК только Der P., однако данные различия не были статистически значимы. Стимуляция МНК периферической крови больных БА и здоровых доноров комбинацией Der p с ЛПС не приводила к достоверному изменению выработки ИЛ - 4 или ИЛ - 13 по сравнению с контролем. Известно, что аллергены вызывают развитие адаптивного иммунного ответа с вовлечением Th2 типа, в последнее время показана важная роль механизмов врожденного иммунитета в развитии аллергических заболеваний. TLR экспрессируются на эпителиальных клетках слизистых дыхательных путей, участвуют в распознавании аллергенов, способствуют переключению иммунного ответа в сторону Th2 типа, поддержании воспаления при аллергических заболеваниях [3]. Согласно литературным данным, важную роль в развитии воспаления играют моноциты, привлеченные в очаг из системного кровотока [4]. В настоящей работе было выявлено увеличение выработки ФНОа МНК периферической крови больных бронхиальной астмой и здоровых доноров в ответ на стимуляцию Der p и комбинацию Der p c ЛПС по сравнению со спонтанной выработкой данного цитокина. При этом, у больных БА спонтанная и индуцированная Der p и Der p в сочетании с ЛПС продукция ФНОа МНК периферической крови статистически достоверно выше, чем у здоровых доноров. Ранее нами было показано, что на моноцитах периферической крови у пациентов с аллергической БА увеличена экспрессия TLR4 и TLR4 - стимулировaннaя ЛПС продукция цитокинов МНК периферической крови [9, 10]. Активация TLR4 и усиление выработки провоспалительных цитокинов в ответ на аллергены клещей домашней пыли может способствовать поддержанию воспаления дыхательных путей и приводить к развитию осложнений.