THE PROCEDURE OF LYMPHOCYTOIMMUNOTHERAPY UNDER PRE-PREGNANCY MANAGEMENT OF WOMEN WITH RECURRENT MISCARRIAGE

Abstract

Full Text

Привычный выкидыш - диагноз, который, согласно определению ВОЗ, устанавливается в случае произошедших подряд трёх и более самопроизвольных прерываний беременности на сроке гестации до 22 недель. У женщин с привычным выкидышем повышена вероятность развития плацентарной недостаточности, наступления преждевременных родов, преждевременного излития околоплодных вод, преждевременной отслойки плаценты [1, 2]. Причины невынашивания беременности многочисленны: • аутоиммунные факторы - наличие в кро ви аутоантител; • тромбофилические - генетически обусловленные тромбофилии; • гормональные - недостаточность лютеи-новой фазы и гиперандрогения различного гене-за; • анатомические - врожденные пороки развития половых органов и приобретенные изменения (внутриматочные синехии, миома матки и др.); • инфекционные - бактериально-вирусная колонизация эндометрия; Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 29 Кречетова Л.В., Вторушина В.В., Голубева Е.Л., Агаджанова А.А., Тетруашвили Н.К. • хромосомные - аномалии кариотипа супругов. Ключевую роль в развитии привычного выкидыша неясного генеза (5-20% в структуре привычного невынашивания беременности) играют аллоиммунные нарушения [3]. По данным зарубежных авторов, шансы доносить беременность без терапии после трёх выкидышей, обусловленных аллоиммунными механизмами, составляют 30%, после четырех - 25%, после пяти - 5% [4, 5]. Поэтому наличие даже двух последовательных выкидышей рассматривается как основание для постановки диагноза «привычный выкидыш», последующего обследования и подготовки к беременности [6]. Показано, что лимфоцитоиммунотерапия (ЛИТ) - введение аллогенных партнерских лимфоцитов женщинам с привычным выкидышем при подготовке к беременности (особенно в супружеских парах с совместимостью по HLA-антигенам), способствует формированию состояния иммунной системы, необходимого для успешной пролонгации беременности [7, 8]. В связи с разнообразием методов выделения лимфоцитов из периферической крови, различиями в количестве вводимых клеток, в кратности и способах введения клеток, а также с разнообразием показателей эффективности иммунизации, однозначных выводов об эффективности данного способа лечения не сделано. ЛИТ широко используется для коррекции привычного невынашивания беременности как в России [9, 10], так и за рубежом [11, 12], однако механизмы влияния аллоиммунизации на имплантацию и гестацию остаются неизученными. В ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» МЗ РФ процедура ЛИТ используется для терапии привычного выкидыша с 1983 года и утвеждена на Учёном совете 25.12.2012 г. для использования в научных исследованиях (Говалло В.И., Сидельникова В.М. Иммунизация беременных женщин аллогенными лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольных выкидышей //Акуш. и гин.-1983.-№12.-С.25-27; Сидельникова В.М, Сухих Г.Т., Кирющенков П.А., Верясов В.Н. Способ лечения невынашивания беременности.//Патент №2283653 от 20.09.06 г.; Сидельникова В.М. Привычная потеря беремен-ности.-М: Триада-Х, 2005.-303 с.; Петросян Л.А. Оптимизация лимфоцитоиммунотерапии в лечении привычной потери беременности первого триместра. Автореф. дис.канд.мед.наук. Москва, 2009.-24 с.; Сидельникова В.М. Подготовка и ве дение беременности у женщин с привычным невынашиванием: метод. пособия и клин. рекомен-дации.-М: МЕДпресс-информ, 2011.-224с.). В качестве прегравидарной подготовки пациенток с привычным выкидышем процедура ЛИТ проводится двукратно на 5-10 день менструального цикла в течение 2-х менструальных циклов. Для проведения ЛИТ используются лимфоциты, соответствующие критериям донорства. Супруги (доноры) обследуются согласно инструкции о медицинском освидетельствовании доноров (Приказ №364 от 14.09.2001г. об утверждении порядка медицинского обследования доноров и компонентов крови с изменениями от 16 апреля, 6 июня 2008 г.). Забор крови из локтевой вены осуществляется в стерильную пробирку объёмом 50 мл, в качестве антикоагулянта используется 200 мкл раствора гепарина (5000МЕ/ мл). Выделение лимфоцитарной взвеси осуществляется в помещении, оснащённом ламинарным боксом. Кровь инкубируется при 37°С в течение 1-1,5 часов. После разделения крови на 2 слоя (верхний - плазма с лимфоцитами и тромбоцитами, нижний - эритроциты), верхний слой переносится в центрифужную стерильную пробирку объёмом 14мл и центрифугируется в течение 7 минут при 1500 об/мин. Затем надосадок удаляется и в пробирку вносится 10мл стерильной дистилированной воды, осадок тщательно ресу-спендируется в течение 10 15 секунд, добавляется избыток физиологического раствора. Пробирка центрифугируется в течение 7 минут при 1500 об/ мин, надосадок удаляляется, к осадку добавляется 2мл стерильного физиологического раствора. В случаях, когда женщина имеет положительный резус-фактор, а её супруг - резус отрицательную кровь, при выделении клеток плазма крови с форменными элементами разводится в 6 мл физиологического раствора и наслаивается на 3 мл фикола 1,077 г/см3 в 2 пробирки. Пробирки центрифугируются в течение 30 минут при 1500 об/ мин. Затем собираются кольца клеток в чистую стерильную пробирку, 2 раза отмываются в 15 мл физиологического раствора в течение 7 минут при 1500 об/мин. Затем надосадок удаляляется, к осадку добавляется 2 мл стерильного физиологического раствора. В полученной взвеси определяется количество клеток путем визуального подсчета в камере Горяева. Окончательная концентрация лимфоцитов в физиологическом растворе доводится до 50 млн в 1 мл. Лимфоцитарная взвесь вводится в ладонную поверхность предплечья внутрикожно в 10-12 30 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Методика проведения лимфоцитиммунотерапии в прегравидарной подготовке женщин с привычным выкидышем точек. Все манипуляции осуществляются с учётом правил асептики и антисептики. В качестве иммунологического маркера эффективности проведения ЛИТ используется определение антиотцовских антител (АОАТ) - количества лимфоцитов с фенотипом CD3+, несущих на своей поверхности антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G, специфичных к антигенам лимфоцитов супруга. Появление в сыворотке крови женщин АОАТ после проведения ЛИТ является одним из показателей формирования иммунного ответа на введение аллогенных клеток. До назначения ЛИТ у женщин с привычным выкидышем определяется низкий уровень АОАТ. Проведение ЛИТ приводит к постепенному повышению уровня АОАТ. Уровень АОАТ, достигнутый после второй процедуры ЛИТ, сохраняется стабильным у забеременевших в дальнейшем женщин на протяжении всего первого триместра [13]. В связи с присутствием в лимфоцитарной взвеси тромбоцитов и возможной аллосенсибилизации к антигенам тромбоцитов было проведено качественное определение антитром-боцитарных антител у 40 женщин до и после проведения 2 процедур ЛИТ (через 2-3 недели) методом иммуноферментного анализа («GENPROBE», США). По результатам исследования у одной женщины антитромбоцитарные антитела определялись как до, так и после проведения ЛИТ (2,5%), а у двух (5,1%) женщин наблюдалось появление слабоположительных результатов на антитела к тромбоцитам после 2 процедур ЛИТ. За период 2012-2015 гг. в рамках грантов Президента РФ ведущих научных школ НШ-366.2012.7 на 2012-2013 гг. «Молекулярные и клеточные механизмы иммунорегуляции процесса гестации в норме и при потерях беременности ранних сроков» и НШ-1694.2014.7 на 2014-2015 гг. «Молекулярные и клеточные механизмы нарушения и коррекции иммунорегуляции процесса гестации при невынашивании беременности» проиммуни-зировано 68 женщин с привычным выкидышем, из них за наблюдаемый период забеременело 57 женщин (83,8%), причем у 39 женщин (68,4%) беременность наступила в течение 6 месяцев после проведения ЛИТ, у двух женщин выполнено прерывание беременности в сроке 12 недель в связи с диагностированными врожденными пороками развития плода (3,5%), у 11 женщин произошла потеря беременности на ранних сроках - до 16 недель гестации (19,3%), преждевременные роды наблюдались у 9 женщин (15,8%), у 35 женщин (61,4%) беременность закончилась рождением живого доношенного ребёнка. Включение лимфоцитоиммунотерапии в алгоритм подготовки женщин с привычным выкидышем является перспективным методом пре-гравидарной подготовки и требует дальнейших исследований для оценки ее эффективности.