Background. According to current views, one of the major mediators involved in the development of allergic process is IL-13. The goal of this work was to design small interfering RNA molecules to effectively inhibit il-13 gene expression of mice in experiments in vitro. Methods. For the expression of IL-13 in in vitro gene coding sequence il-13 was amplified using cDNA ConA-stimulated spleen cells from BALE / c mice as a template and cloned into the expression vector pUCHR IRES GFP. Using a computer analysis were designed six variants of siRNA, directed against mRNA-il-13. To test the efficiency of siRNA a co-transfection of 1x 105 cells HEK293T mixture (0,5 mg and 1 mg of plasmid siRNA) coupled with Lipofectamine 2000 reagent was carried out. Twenty-four hours later, the gene expression changes in il-13 recorded by flow cytometry on the fluorescence intensity of GFP+-cells. Gene expression of il-13 mRNA was assessed by quantitative PCR, and the level of the protein product by ELISA. results. As a result, siRNA molecules were obtained and three of them were able to effectively inhibit the gene expression of il-13. Conclusion. Thereby variants of siRNA, which can effectively inhibit the production of mice’s IL-13 in vitro; can be used later in experiments in vivo so to understand the role of IL-13 in the pathogenesis of allergic conditions as to develop new therapy approaches.
Цель работы. Согласно современным представлениям, одним из основных медиаторов, вовлеченных в развитие аллергического процесса, является IL-13. Целью данной работы было сконструировать молекулы малых интерферирующих РНК для эффективного подавления экспрессии гена il-13 мыши в экспериментах in vitro. Материалы и методы. Для экспрессии IL-13 в условиях in vitro кодирующая последовательность гена il-13 была амплифицирована с использованием кДНК ConA-стимулированных клеток селезенки мышей BALB/c в качестве матрицы и клонирована в экспрессионный вектор pUCHR IRES GFP. Методами компьютерного анализа были спроектированы шесть вариантов siRNA, направленных против мРНК-il-13. Для тестирования эффективности siRNA осуществляли ко-трансфекцию 1х 10 5 клеток HEK293T смесью (0,5 мкг плазмиды и 1 мкг siRNA) с помощью реагента Lipofectamine 2000. Сутки спустя изменения экспрессии гена il-13 фиксировали методом проточной цитометрии по интенсивности флуоресценции GFP+-клеток. Экспрессию гена il-13 на уровне мРНК оценивали методом количественной ПЦР, а на уровне белкового продукта — методом твердофазного ИФА. Результаты. Удалось получить молекулы миРНК, три из которых эффективно подавляли экспрессию гена il-13. Заключение. Таким образом, варианты миРНК, эффективно подавляющие продукцию IL-13 мыши in vitro, в дальнейшем могут быть использованы в экспериментах in vivo как для понимания роли IL-13 в патогенезе аллергических состояний, так и для разработки новых подходов к терапии.