Background. Clinical application of leukocyte histamine release assay (HRA) can be enhanced through the development of automated reversed-phase high-performance liquid chromatography with mass spectrometry (RP-HPLC-MS/MS) employing of whole blood (WB) samples. The purpose of this study was to evaluate the possibility to use WB-HRA technology for the in vitro diagnosis of hypersensitivity employing RP-HPLC-MS/MS. Methods. Method principle: heparinized whole blood samples after substitution of plasma with PIPES buffer («reconstituted» blood) are incubated at 37 °C with different concentrations of substances (allergens, drugs, chemicals, food etc.) suspected in relation to hypersensitivity reactions. Release of histamine is occured mainly from basophilic granulocytes depending on their sensitivity to stimulating substances (allergens etc.). The released histamine is subsequently direct determined in the supernatant using RP-HPLC-MS/MS technology. Heparinized whole blood (8 ml) was drawn from patients with sensitivity to D. pteronyssinus (D1), birch pollen (T3) and peach (F95) confirmed by case history and results of skin prick tests or detection of specific IgE. After removing plasma and substitute it with PIPES buffer aliquots of «reconstituted» blood were put into separate tubes (300-450 μl for macro-method) or to wells of U-shape 96-well micro-titer plate (150-200 μl for micro-method) already contained different concentrations (dilutions) of histamine standard, anti-IgE and allergenic extracts D1, T3, F95 including their chemically modified forms sD1 and sF95. After 1 h incubation at 37 °C tubes or plates were centrifuged and supernatants from each tube (macro-method) or well of the plate (micro-method) were directly analyzed for histamine content by RP-HPLC-MS/MS. Results. It is shown that the levels of histamine released from leukocytes of whole blood of patient sensitized to D. pteronyssinus upon stimulation with non-modified D1 extract are much higher than that of upon stimulation with modified sD1 that means that chemical modification of allergen leads to suppress of B-cell epitopes. It seems that this method is suitable for evaluation of hypersensitivity to allergen, as well as for detection of allergenicity of modified allergens (allergoids). We also found a significant reduction (in 60%) of histamine release from blood leukocytes upon stimulation with T3 extract in patient with sensitivity to birch pollen after allergen-specific immunotherapy (ASIT) in compare to the level of histamine before ASIT. These data indicate that our method of histamine release assay can be convenient as in vitro test for monitoring and evaluation of ASIT efficacy. It was also studied histamine release from blood basophils of patient with sensitivity to peach, confirmed by case history and detection in serum specific IgE. Incubation of patient's whole blood with peach extract (F95) resulted a histamine release at the level comparable to that of stimulated with anti-IgE. This high level of histamine is correlated with the level of allergen-specific serum IgE. Besides the incubation patient's blood with modified peach extract sF95 induced histamine release two times less than that of non-modified F95 indicating substantial reduction of sF95 allergenicity. So this methodology for detection of histamine released from leukocytes of whole blood may be successfully applied for diagnosis of food allergy employing of laboratory made allergenic extracts. Conclusion. Speed and simplicity of performance including the requirement of small quantities of blood makes the WB-HRA employing RP-HPLC-MS/MS a useful laboratory tool not only of scientific interest (detection of allergenicity of modified allergens, peptides etc.) but also of practical significance for evaluation the degree of sensitivity of patients to allergens (including those who received anti-allergic medication or ASIT), analysis of pathophysiological responses to drugs, chemicals and other compounds suspected for their adverse side effects.
Цель работы. Применение в клинике методов оценки гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов цельной крови, может быть усовершенствовано путем применения для определения гистамина современной автоматизированной методики обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с тандемным масс-спектрометром (ОФ-ВЭЖХ-МС/МС). Целью данного исследования являлась оценка возможности определения in vitro гиперчувствительности по высвобождению гистамина из лейкоцитов цельной крови с использованием ОФ-ВЭЖХ-МС/МС. Материалы и методы. Принцип метода: гепаринизированная цельная кровь после замещения плазмы PIPES буфером инкубируется при 37 °С с различными концентрациями тестируемых субстанций (аллергены, лекарственно-диагностические препараты, химические вещества, пищевые продукты и др.), которые подозреваются как вызывающие реакции гиперчувствительности. Высвобождение гистамина происходит в основном из базофильных лейкоцитов в зависимости от их чувствительности к стимулирующим субстанциям (аллергенам и др.). Высвободившийся гистамин после центрифугирования образца крови по завершении инкубации напрямую определяется в супернатанте с использованием технологии ОФ-ВЭЖХ-МС/МС. Гепаринизированную цельную кровь (8 мл) получали от пациентов с сенсибилизацией к клещам домашней пыли D. pteronyssinus (D1), пыльце березы (T3) персику (F95), подтвержденной аллергологическим анамнезом, кожными пробами и/или наличием аллерген-специфического IgE в сыворотке. После замены плазмы на PIPES буфер аликвоты «восстановленной» крови помещали по 300-450 мкл в отдельные пробирки (макрометод) или по 150-200 мкл в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном (микрометод), где уже находились различные концентрации (разведения) гистамина (стандарт для калибровки), анти-IgE антител, аллергенных экстрактов D1, T3, F95, включая их химически модифицированные формы sD1 и sF95. Через час инкубации при 37 °С пробирки или планшеты центрифугировали и в супернатантах напрямую определяли содержание гистамина путем ОФ-ВЭЖХ-МС/МС. Результаты. Показано, что уровни гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов цельной крови больного с сенсибилизацией к D. pteronyssinus в ответ на стимуляцию немодифицированным экстрактом D1, значительно выше тех, которые наблюдаются при стимуляции модифицированным sD1, что свидетельствует о блокаде В-клеточных эпитопов в процессе модификации аллергенов экстракта D1. Данный метод определения гистамина может быть полезен не только для выявления гиперчувствительности к конкретному аллергену, но также и для оценки аллергенности модифицированных аллергенов (аллергоидов). Также показано значительное (на 60%) снижение уровня высвобождения гистамина из лейкоцитов крови больного с сенсибилизацией к пыльце березы после аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) по сравнению с уровнем гистамина до АСИТ, что позволяет рассматривать данный метод как удобный тест in vitro для мониторинга и оценки эффективности АСИТ. Изучено высвобождение гистамина из лейкоцитов цельной крови больного с сенсибилизацией к аллергенам персика, подтвержденной аллергологическим анамнезом и наличием сывороточного аллерген-специфического IgE. Показано, что инкубация цельной крови этого пациента с экстрактом персика (F95) стимулирует высвобождение гистамина, сравнимое с таковым при стимуляции анти-IgE антителами, что также коррелирует с уровнем аллерген-специфического сывороточного IgE. Кроме того, инкубация лейкоцитов крови этого пациента с модифицированным экстрактом sF95 индуцирует высвобождение гистамина в значительно меньшей степени, что свидетельствует о существенном снижении аллергенности модифицированного sF95. Данная методология выявления повышенной чувствительности по высвобождению гистамина из лейкоцитов цельной крови может быть применима для диагностики пищевой аллергии с использованием лабораторно приготовленных аллергенных экстрактов. Заключение. Быстрота и простота исполнения метода оценки гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов цельной крови, а также малые количества крови для анализа делают этот подход, использующий для определения гистамина технологию ОФ-ВЭЖХ-МС/МС, полезным не только для научных исследований (определение аллергенности модифицированных аллергенов, пептидов и др.), но и для практического применения при оценке степени сенсибилизации пациентов к аллергенам (включая тех, кто получал медикаментозное антиаллергическое лечение или АСИТ), при анализе патофизиологического ответа организма на лекарства, химические соединения и другие субстанции, подозрительные в отношении побочных эффектов.