The role of connexin 43 in the pathogenesis of bronchial asthma in children

Full Text

Обоснование

По современным данным, коннексины представляют собой семейство трансмембранных белков, участвующих в синхронизации клеточных функций, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и др. Иными словами, коннексины — белки щелевых контактов, участвующие в межклеточной коммуникации. Щелевые соединения обеспечивают взаимодействие между клетками для обмена небольшими метаболитами и играют важную роль в регуляции и поддержании тканевого гомеостаза. Они также обеспечивают обмен ионами и мелкими молекулами между внутриклеточной и внеклеточной средой. Механизм работы канала основан на аналогичном принципе для коннексинов. Собираясь в плазматической мембране, коннексины образуют щелевые контакты из 6 субъединиц, формирующих коннексон. Коннексоны соединяют 2 соседние клетки, образуя между ними канал, который обеспечивает транспорт ионов, питательных веществ, сигнальных молекул, а также микроРНК. Работа этих молекулярных механизмов зависит от множества факторов, в частности внутриклеточной концентрации кальция, изменений напряжения клеточной мембраны и pH внутри клетки [1–3].

Поскольку различные нарушения в регуляции межклеточной коммуникации могут способствовать развитию бронхиальной астмы (БА), более глубокое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе работы различных коннексинов в каналах щелевых контактов, позволит в перспективе разработать терапевтические подходы, которые будут либо подавлять, либо стимулировать работу определенного коннексина, учитывая его важнейшие функции в межклеточных коммуникациях.

Цель исследования — анализ показателей коннексина 43 (Сх43) в сыворотке крови детей с БА различной степени тяжести.

Методы

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое проспективное сплошное контролируемое рандомизированное исследование в период с 2023 по 2024 г. с применением лабораторного, статистического, аналитического методов, текущего наблюдения и кабинетного исследования.

Верификация диагноза БА проведена на основании клинико-анамнестических данных, а также результатов дополнительных методов исследования в соответствии с действующими клиническими рекомендациями.

Критерии соответствия

Критерии включения: девочки и мальчики в возрасте 6–18 лет с установленным диагнозом БА; наличие подписанного пациентом (в возрасте старше 15 лет) или родителями (для детей младше 15 лет) информированного согласия на проведение исследования.

Критерии невключения: отсутствие информированного согласия; наличие сопутствующей хронической бронхолегочной патологии; крайне тяжелое состояние больного, требующее проведения реанимационных мероприятий; отказ от проведения необходимых лечебных и диагностических мероприятий; указание на проведение аллергенспецифической иммунотерапии в анамнезе; применение системной терапии кортикостероидами, циклоспорином, биологическими препаратами за 6 мес до и в течение всего периода исследования.

Критерии исключения: тяжелое состояние больного, требующее применения в ходе исследования системной терапии кортикостероидами или биологическими препаратами.

Контрольная группа сформирована из 30 детей I и IIа групп здоровья без отягощенного аллергологического анамнеза, обучающихся в средней образовательной школе г. Ростова-на-Дону. Возраст детей в группе контроля варьировал от 6 до 18 лет.

Условия проведения

В исследование включены дети, получающие амбулаторное и стационарное лечение в Лечебно-реабилитационном центре № 1.

Описание медицинского вмешательства

Клиническое обследование включало сбор анамнеза и физикальное обследование.

Для определения лабораторных показателей у детей основной и контрольной групп проведен забор крови из кубитальной вены. Количественное определение уровня коннексина в сыворотке крови проводили иммуноферментным анализом с использованием набора SEA277Hu (Cloud-Clone Corporation, Ухань, КНР) на базе центральной научно-исследовательской лаборатории Ростовского государственного медицинского университета.

Основной исход исследования

Проведен анализ показателей Сх43 в сыворотке крови больных БА и пациентов контрольной группы, а также установлены особенности концентрации данного белка у детей с различной степенью тяжести заболевания.

Дополнительные исходы исследования

Проведен анализ показателей Сх43 в зависимости от анамнестических данных и результатов дополнительных методов обследования. Определены взаимосвязи между полом и возрастом, уровнем и спектром сенсибилизации, продолжительностью заболевания и базисной терапии, концентрацией общего иммуноглобулина E в сыворотке крови, а также показателями функции внешнего дыхания.

Анализ в подгруппах

В ходе исследования сформированы 3 подгруппы больных БА в зависимости от тяжести течения заболевания: пациенты с легкими проявлениями, среднетяжелым и тяжелым течением. Степень тяжести заболевания определяли согласно клиническим рекомендациям по БА 2024 г.

Методы регистрации исходов

Для регистрации исходов нами разработана индивидуальная карта пациента, включающая данные общеклинического и лабораторно-инструментального обследования, а также показатели уровня Сх43 в сыворотке крови (нг/мл).

Этическая экспертиза

Проведение исследования согласовано и одобрено локальным этическим комитетом Ростовского государственного медицинского университета (выписка из протокола № 21/23 от 21 сентября 2023 г.). Пациентам, включенным в исследование, предоставлена подробная информация о целях и процедуре его проведения. Всеми больными подписаны информированные согласия (в случае детей до 15 лет согласие подписывали родители).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывали. Для сбора и хранения данных использовали индивидуальные регистрационные карты. Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 12.0 для Windows (Microsoft Corporation, США). Статистическую значимость различий между группами по среднеарифметическим величинам при нормальном законе распределения определяли по t-критерию Стьюдента. В случае если распределение показателей отличалось от нормального, нами был использован непараметрический критерий Манна–Уитни. Во всех случаях статистически значимым считали результат при t >2 и р <0,05.

Результаты

Проведено обследование 125 детей с установленным диагнозом БА: 86 (68,8 %) мальчиков и 39 (31,2 %) девочек. Средний возраст обследованных пациентов составил 11,23 ± 4,10 года. Результаты комплексного клинико-лабораторного обследования показали, что большинство больных имели легкое течение БА (n = 68 (54,4 %)), в то время как среднетяжелые проявления заболевания отмечались у 36 (28,8 %) детей, а тяжелые — у 21 (16,8 %).

Основные результаты исследования

У больных, страдающих БА, показатели Cx43 в сыворотке крови (0,24 [0, 19; 0, 34] нг/мл) превышали результаты, установленные в группе контроля (0,16 [0, 13; 0, 19] нг/м) (р = 0,0002).

При этом значения, зарегистрированные в группе больных тяжелой БА, выше, чем в группе пациентов с легкой БА (табл. 1).

 

Таблица 1. Медиана показателей уровня коннексина 43 у больных бронхиальной астмой (БА) различной степени тяжести [Q₂₅; Q₇₅], нг/мл

Table 1. Median indicators of the level of connexin 43 in patients with various forms of asthma [Q₂₅; Q₇₅], ng/mL

Легкое течение (n = 68) Mild form (n = 68)	Среднетяжелое течение (n = 36) Moderate-to-severe form (n = 36)	Тяжелое течение (n = 21) Severe form (n = 21)	p
1	2	3
0,20 [0, 17; 0, 28]	0,26 [0, 23; 0, 29]	0,36 [0, 35; 0, 39]	р1, 2, 3 <0,0001; р1, 2 = 0,250; р2, 3 <0,0001; р1, 3 <0,0001
Примечание. Р1, 2, 3 — значимость различий в 3 группах ; p1, 2 — значимость различий между легким и среднетяжелым течением БА; p1, 3 — значимость различий между легким и тяжелым течением БА; p2, 3 — значимость различий между среднетяжелым и тяжелым течением БА; жирным выделены значения р <0,05. Note. p1, 2, 3 — significance of the difference in 3 groups (according to Kruskal-Wallis criterion); p1, 2 — significance of the difference between mild and moderate-to-severe forms of BA; p1, 3 —significance of the difference between moderate-to-severe and severe forms of BA; p-values <0.05 are highlighted in bold.

 

Выявлена прямая корреляционная зависимость между концентрацией Cx43 в сыворотке крови больных и степенью тяжести заболевания (r = 0,504) (рис. 1). Следовательно, чем тяжелее состояние больного, тем выше показатели Сх43 в сыворотке крови.

 

Рис. 1. Линия регрессии и корреляционное поле точек связи степени тяжести бронхиальной астмы с концентрацией коннексина 43 в сыворотке крови больных.

Fig. 1. Regression line and correlation field of connection points between the severity of asthma and the concentration of connexin 43 in the blood serum of patients.

 

Результаты анализа сопряженности анамнестических данных и показателей Cx43 в сыворотке крови продемонстрировали, что концентрация данного мембранного канального белка не зависит от пола и возраста обследованных пациентов (р >0,05). Однако у больных БА, имеющих поливалентную сенсибилизацию, концентрация Cx43 в сыворотке крови была выше (0,39 [0, 36; 0, 42] нг/мл) по сравнению с пациентами, отмечавшими аллергическую реакцию на 1 вид аллергенов (0,20 [0, 17; 0, 25] нг/мл) (р <0,0001) (табл. 2).

 

Таблица 2. Показатели уровня коннексина 43 в сыворотке крови больных бронхиальной астмой в зависимости от уровня сенсибилизации

Table 2. Indicators of connexin 43 in the blood serum of patients with asthma, depending on the level of sensitization

Уровень сенсибилизации Level of sensitization	Медиана уровня коннексина 43 [Q25; Q75], нг/мл Median of connexin 43 level [Q25;Q75], ng/mL	p
Сенсибилизация к 1 виду аллергена Sensitization to 1 type of allergen	0,20 [0, 17; 0, 25]	р1, 2 = 0,016; р1, 3 <0,0001; р1, 4 <0,0001; р2, 3 = 0,659; р2, 4 = 0,005; р3, 4 = 0,121; р1, 2, 3, 4 <0,0001
Сенсибилизация к 2 видам аллергенов Sensitization to 2 types of allergens	0,27 [0, 19; 0, 34]
Сенсибилизация к 3 видам аллергенов Sensitization to 3 types of allergens	0,33 [0, 25; 0, 35]
Поливалентная сенсибилизация Polyvalent sensitization	0,39 [0, 36; 0, 42]
Примечание. р — значимость различий в группах; жирным выделены значения р <0,05. Note. p1, 2, 3 — significance of the difference in all groups (according to Kruskal–Wallis criterion); p-values <0.05 are highlighted in bold.

 

Следовательно, можно предположить, что нарушение формирования щелевидных контактов у больных БА, сопряженное с повышенным уровнем Cx43 в сыворотке крови, способствует быстрому проникновению аллергена через слизистую оболочку и формированию более выраженного иммунного ответа на значимую молекулу вещества. При этом у детей с проявлениями пыльцевой сенсибилизации уровень Cx43 0,24 [0, 19; 0, 33] нг/мл не имеет статистически значимых отличий от пациентов с пищевой аллергией (0,27 [0, 22; 0, 35] нг/мл) (р = 0,16). Между уровнями общего иммуноглобулина E и Сх43 в сыворотке крови больных также отсутствует прямая корреляционная зависимость (р >0,05).

Результаты анализа полученных данных также позволили выявить корреляционную взаимосвязь между продолжительностью базисной терапии и концентрацией Cx43 в сыворотке крови обследованных детей (r = 0,49). Значения Cx43 у больных с более длительным стажем заболевания не имели отличий от пациентов с длительностью БА до 1 года (р >0,05).

Также проведен корреляционный анализ показателей функции внешнего дыхания и концентрации Cx43 в сыворотке крови больных. Выявлена тенденция к увеличению значений данного белка в сыворотке крови пациентов, имевших низкие показатели пиковой скорости выдоха (r = −0,19).

Нежелательные явления

Нежелательные явления отсутствовали.

Обсуждение

По результатам проведенных нами исследований установлено, что у больных БА отмечалось значимое повышение уровня Сх43 в сыворотке крови. При этом чем тяжелее течение заболевания, тем выше показатели. Принимая во внимание тот факт, что коннексин является белком щелевых контактов, участвующим в межклеточной коммуникации, можно предположить, что его повышенное содержание в сыворотке крови может быть косвенным свидетельством разрушения эпителиального барьера у больных, страдающих тяжелой формой БА [2].

В литературе представлено немало работ, в которых демонстрируется доказанная значимость Cx43 в функционировании дыхательной системы, в частности альвеол легких, поэтому следует уделить особое внимание роли Cx43 в патогенезе БА. Так, в экспериментальных исследованиях установили, что Cx43 экспрессируется в эмбрионе мыши уже на 14–15-й день, а также во взрослом эпителии дыхательных путей, альвеолярных клетках I и II типов, эндотелии, фибробластах и гладкомышечных клетках легких. У мышей с дефицитом Cx43 альвеолы сужены и развиваются медленнее из-за снижения экспрессии важных факторов, таких как сурфактантный белок C и α-актин гладких мышц [2, 4].

Коннексины играют важную роль в патогенезе БА и хронического воспаления дыхательных путей, сопровождающегося обструкцией, одышкой и затрудненным дыханием. В 2017 г. ученые из Ягеллонского университета исследовали роль Cx43 в процессе трансформации фибробластов в миофибробласты под воздействием трансформирующего фактора роста (TGF) β. Они изучали клетки, полученные из биопсий бронхов пациентов с астмой и здоровых доноров. Установлено, что фибробласты астматиков демонстрируют значительно повышенные уровни Cx43 и бÓльшую склонность к миофибробластной дифференцировке, вызванной TGF-β1, по сравнению с клетками здоровых людей. Временное снижение экспрессии Cx43 в фибробластах астматиков с помощью малых интерферирующих РНК смягчало активацию и образование миофибробластов, индуцированных TGF-β. Эти результаты позволяют предположить, что Cx43 играет прямую роль в механизме, контролирующем TGF-β-зависимую дифференцировку фибробластов бронхов, тем самым способствуя развитию фиброза при БА [3, 5, 6].

Ранее было обнаружено, что экспрессия коннексина 37 и Cx43 в эпителии бронхов мышей с астмой коррелирует с тяжестью воспаления дыхательных путей, их реактивностью и концентрацией Th2-цитокинов в легких [1, 7, 8]. В 2018 г. группой исследователей было показано, что Cx43 активно экспрессируется резидентными клетками легких, такими как эпителиальные, альвеолярные клетки и фибробласты, что указывает на их вклад в инициацию астматического воспаления [8–10].

Результаты этих исследований согласуются с нашими данными. Cx43 экспрессируется клетками, играющими ключевую роль в аллергических реакциях, такими как тучные клетки, высвобождающие медиаторы, вызывающие бронхоспазм, пропотевание жидкости из сосудов и привлечение воспалительных клеток; следовательно, изучение изменений концентрации данного цитокина у больных с различными по тяжести проявлениями БА представляет большой научный и практический интерес [11–15].

Заключение

Изучение патогенеза БА — непростая задача, но чем лучше мы понимаем клеточные механизмы, связанные с щелевыми контактами, в частности с Cx43, тем больше у нас знаний, необходимых для понимания того, на каких стадиях заболевания может быть наиболее эффективно прерывание или стимулирование активности Cx43. Таким образом, считаем перспективным и целесообразным определение роли межклеточных щелевых контактов и молекулярных механизмов, лежащих в основе работы различных коннексинов в щелевых каналах, что позволит в перспективе разработать терапевтические подходы, которые будут либо подавлять, либо стимулировать работу Cx43 с учетом его непосредственной роли в патогенезе БА.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFORMATION

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования и подготовке публикации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведенным исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. О.Е. Семерник — разработка концепции и дизайна исследования, подготовка и написание текста статьи; А.С. Малышева — обследование и наблюдение пациентов, сбор и анализ лабораторных данных; А.А. Лебеденко — обзор литературы, сбор и анализ источников литературы, редактирование статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. O.E. Semernik — concept and design development, preparation and writing the article; A.S. Malysheva — examination and observation of patients, collection and analysis of literary data, analysis of the obtained laboratory data; A.A. Lebedenko — literature review, collection and analysis of literary sources, editing the article. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

About the authors

Olga E. Semernik

Rostov State Medical University

Author for correspondence.
Email: semernick@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3769-8014
SPIN-code: 1890-5470

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Rostov-on-Don

Anna S. Malysheva

Medical and Rehabilitation Center No. 1, Rostov-on-Don

Email: rozadem@mail.ru
Russian Federation, Rostov-on-Don

Aleksandr A. Lebedenko

Rostov State Medical University

Email: leb.rost@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4525-1500
SPIN-code: 5493-6114

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Rostov-on-Don

References

Supplementary files