Cationic peptides as promising compounds for the treatment of bacterial complications in atopic dermatitis: Antibacterial activity assessment

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Атопический дерматит (АтД) ― это мультифакторное генетически детерминированное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением, возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения [1]. АтД отмечается у лиц всех возрастных групп вне зависимости от страны проживания, а частота встречаемости среди всех кожных заболеваний составляет 20–40%. Распространённость АтД среди взрослого населения составляет 2–8%, среди детей ― до 20% [2].

Пациенты с АтД и лица, осуществляющие уход за ними, испытывают снижение качества жизни, в частности изменение повседневной деятельности, нарушение сна, тревогу и депрессию [3]. В настоящее время отмечается также тенденция к развитию тяжёлых, непрерывно рецидивирующих форм АтД, устойчивых к стандартной терапии. Кроме того, распространённость кожных и системных инфекций при АтД значительно выше, чем при других заболеваниях, поскольку пациенты с АтД имеют повышенный риск развития инфекционных осложнений, в том числе бактериемий, герпетической экземы, инфекций кожи и мягких тканей [4, 5]. Staphylococcus aureus, бета-гемолитические стрептококки являются наиболее распространёнными микроорганизмами, которые вызывают бактериальные осложнения АтД [6, 7].

Профилактическая терапия АтД основана на методах лечения, направленных на уменьшение воспаления и восстановление кожного барьера, тогда как в отношении локальных и системных инфекций применяют антибактериальные и противовирусные препараты.

С момента открытия пенициллина в 1928 году антибиотики остаются наиболее востребованными препаратами для лечения многих бактериальных инфекций. К сожалению, в настоящее время стало очевидным, что нерегулируемое чрезмерное использование антибиотиков не только способствует развитию резистентности бактерий, но и повышает вероятность их эволюции за счёт увеличения частоты мутаций, рекомбинации и горизонтального переноса генов [8–10]. Потеря эффективности часто используемых антимикробных соединений обусловливает необходимость поиска новых подходов к лечению инфекционных заболеваний, включая модификацию имеющихся лекарственных средств и разработку новых антибактериальных препаратов, к которым у микроорганизмов не будет развиваться резистентность.

Низкая по сравнению с антибиотиками вероятность развития спонтанной резистентности показана для таких соединений, как катионные пептиды. Фармакодинамические исследования свидетельствуют, что это одно из важнейших предполагаемых преимуществ катионных антимикробных пептидов (КАМП). Несмотря на то, что в литературе описаны случаи развития устойчивости к антимикробным пептидам в системах in vitro [11], для систем in vivo это не так характерно [12], что, предположительно, обусловлено множеством различных механизмов, с помощью которых КАМП взаимодействуют с мишенью [13]. Традиционные антибиотики имеют специфические внутриклеточные мишени, КАМП же способны нарушать жизнедеятельность клеток как проникая внутрь, так и взаимодействуя с мембраной. Поскольку большинство антимикробных пептидов являются катионными и обладают литической активностью, низкая способность бактерий к развитию в отношении них резистентности может быть связана с особым способом воздействия КАМП на мембрану бактериальной клетки, а именно посредством электростатических взаимодействий [14, 15]. Следует отметить, что большинство описанных механизмов резистентности связаны с модификациями клеточной стенки, такими как, например, изменение суммарного заряда поверхности клетки [16].

Выраженная антибактериальная активность линейных КАМП сопряжена с наличием довольно сложной трёхмерной структуры и дисульфидных связей, а также малой доступностью для практического применения. В связи с этим помимо линейных катионных пептидов активно изучаются антимикробные пептидные дендримеры, которые, напротив, ввиду относительной протеолитической стабильности и возможности создания на их основе структур, близких по дизайну к природным лигандам соответствующих мишеней, являются перспективными соединениями.

Дендримеры (от греч. dendros ― дерево, ветвь, meros ― часть) ― это полимерные молекулы с симмет-ричной древовидной структурой с регулярным разветвлением, обладающие свойствами, совершенно отличными от линейных полимеров. В то время как на основе дендримеров активно разрабатываются наносистемы для доставки лекарств и генов, изучение антимикробных свойств антимикробных пептидных дендримеров находится на начальной стадии и является актуальной задачей. Однако было показано, что пептидные дендримеры активны относительно бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, а также биоплёнок [17].

Идентификация антимикробных пептидов и изучение особенностей их строения привели к разработке нового класса препаратов путём конструирования синтетических молекул на основе известных природных структур. Понимание того, как свойства антимикробных пептидов зависят от аминокислотной последовательности, позволит своевременно реагировать на появление новых, устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий за счёт целенаправленной реконструкции последовательностей КАМП [17, 18].

Являясь биологически активными соединениями, КАМП протеолитически неустойчивы. В качестве несущего элемента для КАМП с формированием стабильного гибридного соединения может быть использован фуллерен С60, выполняющий роль транспортёра. Клеточно-проникающая способность фуллерена С60, а также отсутствие иммуногенности и аллергенности являются существенным преимуществом таких транспортёров. Молекулы фуллерена обладают структурой замкнутой поверхности с сильно развитой системой π-электронов, придающих ей высокую поляризуемость. Фуллерены способны принимать участие в реакциях присоединения, используя которые можно получить широкий спектр продуктов с разнообразными физико-химическими и биологическими свойствами. Среди известных фуллеренов наиболее изученным соединением является С60, характеризующийся низкой токсичностью, способностью проникать через биологические мембраны и отсутствием иммуногенности [19, 20].

Токсикология фуллерена является предметом многих дискуссий, однако в большинстве работ показано, что чис- тый фуллерен в форме водных дисперсий не обладает токсичностью. Так, водорастворимые производные фуллерена не проявляют острой токсичности in vivo даже в достаточно высоких дозах [21]. Показано также, что величина LD50 для фуллеренола С60ОН18 при внутрибрюшинном введении мышам равна 1,2 г/кг [22].

Известно, что фуллерен С60 проявляет множество видов биологических эффектов, включая противовирусные, противораковые, антиоксидантные и цитопротекторные. Он может также подавлять развитие воспалительных процессов, вызванных оксидативным стрессом, за счёт активации фагоцитарных реакций. Так, введение водного раствора фуллерена С60 вызывает адгезию и миграцию нейтрофилов и макрофагов в очаг воспаления с последующим обнаружением его в фаголизосомах клеток. При этом блокируется синтез провоспалительных цитокинов ― фактора некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor alpha, TNF-α), интерлейкинов 6 и 8 (interleukin, IL-6, IL-8), из них IL-8 является ключевым хемоаттрактантом для нейтрофилов [23]. В нейтрофилах процесс кислородзависимого фагоцитоза сопровождается активной секрецией фермента миелопероксидазы, катализирующей токсическое действие перекиси водорода на различные микроорганизмы. Установлено, что С60 в определённой дозе ингибирует активность этого фермента в нейтрофилах [24, 25].

На модели АтД нами показана также противоаллергическая активность водного раствора фуллерена. Было установлено, что водный раствор фуллерена значительно снижал кожное воспаление, вызванное аллергенным белком овальбумином, и в существенной степени увеличивал экспрессию гена, кодирующего важнейший белок кожного барьера филаггрин. На модели АтД было показано, что обработка водным раствором фуллерена улучшает гистологическую картину кожи, способствует снижению уровней специфического иммуноглобулина Е (immunoglobulin Е, IgE) и Th2-цитокинов (IL-4, IL-5), при этом выработка Th1-цитокинов (IL-12, интерферон гамма) увеличивалась [26]. Важной особенностью молекулы фуллерена является и то, что свободные радикалы, находящиеся на её поверхности, способны негативно воздействовать на клетки микроорганизмов, увеличивая проницаемость их оболочки для воздействия терапевтических молекул, таких как КАМП, и приводя, в конечном итоге, к фатальному нарушению жизнедеятельности.

Таким образом, гибридные соединения на основе фуллерена С60 и катионных пептидов, слабо подверженных биодеградации, должны, на наш взгляд, обладать спектром биологических активностей, а их создание является крайне перспективным направлением для исследований.

Цель исследования ― дизайн, синтез и оценка антибактериальной активности катионных пептидов и водного раствора фуллерена С60 для создания на их основе препаратов, которые, предположительно, должны обладать спектром биологической активности, в том числе противовоспалительной, противоаллергической и антибактериальной, для терапии бактериальных осложнений при АтД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Водный раствор фуллерена

Водный раствор фуллерена был получен диализным методом, как описано ранее [27]. Этот метод обеспечивает высокий выход фуллерена C60 из кристаллического состояния в раствор, при этом гидродинамический размер частиц, определённый методом динамического светорассеяния, составляет 100–200 нм. В настоящей работе исходная концентрация стерильного раствора фуллерена С60 составляла 1 мг/мл.

Катионные пептиды

Синтез пептидов проводили твёрдофазным методом, используя автоматический синтезатор пептидов PS3 Peptide Synthesizer (Gyros Protein Technologies Inc., США), по протоколу Fmoc-химии, используя смесь N-гидроксибензотриазола с диизопропилкарбодиимидом как конденсирующий агент (HOBt/DIC). В синтезе использовали стартовые Fmoc-аминоацил-полимеры, смолу гелевого типа Rink Amide СhemMatrix (IRIS BioTech, Канада). Пептиды очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (препаративный хроматограф LC-20 Shimadzu) на колонке с обращённой фазой (С18). Соответствие их рассчитанной молекулярной массе было подтверждено масс-спектрометрией (Microflex™ LT MALDI-TOF, BrukerDaltonics, Германия).

Анализ антибактериальной активности катионных пептидов

Антибактериальную активность водного раствора фуллерена, линейных и дендримерных катионных пептидов оценивали in vitro с использованием лабораторного неинфекционного (без О-антигена) бактериального штамма Escherichia coli Dh5α (18265017, Thermo Fisher Scientific, США) методами диффузии в агар с использованием дисков и подсчёта колоний. В качестве положительного контроля служил антибиотик ампициллин.

Анализ антибактериальной активности методом диффузии в агар. На чашку Петри высевали бактериальную культуру E. coli Dh5α и инкубировали 24 часа при 37°C. Бактериальную культуру для анализа готовили путём инокуляции профламбированной микробиологической петлёй 2–3 изолированных колоний E. coli Dh5α в жидкую питательную среду LB (lysogeny broth). Культуру инкубировали 4 часа при 37°C и встряхивании со скоростью 200 об./мин до получения оптической плотности бактериальной культуры при 620 нм 0,3–0,35 опт.ед. Для анализа антибактериальной активности бактериальный инокулят наносили на поверхность агаризованной среды в объёме 500 µl. Далее стерильным пинцетом на инокулированную поверхность агара помещали бумажные диски, пропитанные определённой концентрацией исследуемого пептида. В качестве положительного контроля использовали антибиотик ампициллин (10 µg на диск), в качестве отрицательного контроля ― фосфатно-солевой буфер (phosphate-buffered saline, PBS). Чашки инкубировали в течение 16–24 часов при 37°C. Результаты фиксировали путём измерения диаметра зоны лизиса с точностью до миллиметра.

Оценка антибактериальной активности методом подсчёта колоний. Бактериальную суспензию для анализа готовили путём инокуляции изолированных колоний в жидкую питательную среду LB (lysogeny broth). Культуру инкубировали (37°C, 200 об./мин) до получения оптимальной оптической плотности (при 620 нм 0,3–0,35 опт.ед.), после чего разводили в среде LB в соотношении 1:2 и вносили в лунки плоскодонного 96-луночного планшета для культивирования клеток. В течение 15 минут после приготовления суспензии в лунки с инокулятом вносили рабочие разведения исследуемых пептидов или положительного контроля (антибиотик ампициллин) в концентрациях 0,7, 0,14, 0,03 и 0,01 ммоль/л. В качестве отрицательного контроля были приняты лунки с бактериальной культурой в среде LB без антибактериальных агентов. Инокулированный планшет инкубировали 4 часа (37°C, 200 об./мин). По окончании инкубации готовили серию десятикратных разведений испытуемых концентраций, а также отрицательного контроля на среде LB, а затем из автоматической пипетки отдельными каплями объёмом 10 µl наносили разведения на поверхность плотной питательной среды. Чашки Петри с каплями инкубировали в течение 16–24 часов при 37°C. Результаты антимикробной активности оценивали путём подсчёта колоний и расчёта минимальной бактерицидной концентрации, за которую принимали минимальную концентрацию, обеспечивающую гибель 99,9% микроорганизмов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проектирование структуры пептидов

На первом этапе исследований нами была создана библиотека катионных пептидов, которые, предположительно, должны обладать высокой противомикробной активностью и низкой токсичностью. Для разработки панели катионных пептидов мы опирались на базы данных уже имеющихся пептидов, а также на данные литературы по биологической (антибактериальной) активности катионных пептидов. Так, например, для некоторых последовательностей мы взяли фрагменты такого пептида, как LL-37, который обладает показанной противомикробной активностью, однако является, на наш взгляд, весьма длинным [28]. Проанализировав его последовательность, мы попытались выявить наиболее активный фрагмент, который использовали для конструирования собственной пептидной библиотеки.

Далее для конструирования других пептидов мы взяли за основу другой линейный α-спиральный пептид ― KKLRLKIAFK, описанный в литературе, который, в свою очередь, является модификацией последовательности MARNKPLGKKLRLAAAFK, выделенной из Pyrobaculum aerophilum [29]. Данный пептид наряду с невысокой токсичностью отличался относительно короткой последовательностью и широким спектром описанной активности. Так, показана его активность против 15 штаммов таких патогенов, как Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, и главное ― против такого важного патогена, как Pseudomonas aeruginosa.

Основой для ещё одного ряда пептидов стали пептиды из панели SAAP, обладающие повышенной антимикробной активностью относительно LL-37 [30]. Так, например, пептид SAAP-148 проявлял активность относительно биоплёнок, которые являются огромнейшей проблемой стационаров и других медицинских учреждений. Важно отметить, что SAAP-148 был активен в физиологических условиях и эффективен относительно устойчивых к метициллину S. aureus и обладающей в том числе множественной устойчивостью A. baumannii.

В процессе дизайна катионных пептидов мы использовали также элементы чередования гидрофильных и гидрофобных аминокислот. Такие фрагменты в гидрофобной среде (липидные мембраны клеток) приобретают конформацию амфифильной спирали благодаря участию водородных связей, стимулируя транслокацию пептида через мембрану. Селективная активность КАМП в отношении клеток млекопитающих и бактерий основана на различии в их структуре, фосфолипиды бактериальных мембран несут более отрицательный заряд. Ввиду этого КАМП имеет большее сродство к поверхности клетки, а его амфифильность облегчает проникновение внутрь бактерии или дестабилизацию бактериальной мембраны. Разработка структуры антибактериальных катионных пептидов основана на построении оптимального баланса между положительно заряженными и гидрофобными аминокислотами с учётом базы данных по антимикробным пептидам [31–33] и введении разветвлённых цепей (дендримеризация). Наличие в молекуле катионных пептидов нескольких идентичных цепей, несущих позитивный заряд, способствует кооперативным взаимодействиям пептида с мембраной клетки.

Таким образом, с целью поиска уникальной пептидной последовательности с достаточной антибактериальной активностью и умеренной цитотоксичностью нами была создана библиотека из 42 катионных пептидов, которые содержали от 7 до 25 аминокислот с зарядами от +5 до +16. Молекулярная масса пептидов составляла не более 5000 Да.

Спроектированные пептидные последовательности далее были синтезированы и проанализированы на наличие противомикробной активности.

Скрининг катионных пептидов в отношении штамма E. coli Dh5α на наличие антибактериальной активности

Методом диффузии в агар с использованием дисков было показано, что водный раствор фуллерена не обладает антибактериальной активностью, однако 15 из 42 синтезированных пептидов показали активность в отношении штамма E. coli Dh5α. После анализа структурных характеристик активных пептидов были отобраны 6 наиболее перспективных, на наш взгляд, последовательностей. Антибактериальная активность отобранных катионных пептидов представлена в виде процента зоны лизиса относительно контрольного препарата (антибиотик ампициллин); табл. 1.

 

Таблица 1. Антибактериальная активность катионных пептидов, определённая методом диффузии в агар с использованием дисков

Table 1. Antibacterial activity of cationic peptides determined by agar diffusion method

№	Шифр	M, г/моль	Заряд, рН 7	Зона лизиса, %
1	AB-11	2633	+10	15
2	AB-14	2638	+8	50
3	AB-15	2773	+10	45
4	AB-16	2669	+16	10
5	AB-17	2079	+8	40
6	AB-18	2506	+11	48

 

Таким образом, процент зоны лизиса (относительно зоны лизиса при нанесении ампициллина) катионных пептидов с шифрами АВ-11, АВ-14, АВ-15, АВ-16, АВ-17, АВ-18 составил 15, 50, 45, 10, 40 и 48 соответственно. Для всех указанных пептидов была изучена способность проявлять бактерицидную активность в отношении указанного бактериального штамма.

Анализ бактерицидной активности катионных пептидов

С помощью метода подсчёта колоний было показано, что все 6 отобранных пептидов продемонстрировали различную степень бактерицидной активности в отношении штамма E. coli Dh5α. Сводные данные, содержащие информацию о минимальных бактерицидных концентрациях указанных пептидов, представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Катионные пептиды, обладающие антибактериальной активностью в отношении E. coli Dh5α

Table 2. Cationic peptides with antibacterial activity against E. coli Dh5α

№	Шифр	Минимальная бактерицидная концентрация, ммоль/л
1	AB-11	0,74
2	AB-14	0,03
3	AB-15	0,74
4	AB-16	0,74
5	AB-17	0,74
6	AB-18	0,15

 

Наибольший интерес для дальнейших исследований представляют, на наш взгляд, пептиды с шифрами АB-14, AB-17 и AB-18. На рис. 1 представлены данные относительно бактерицидной активности пептида AB-18. Видно, что бактерицидная активность ампициллина, где наблюдалось полное отсутствие роста бактериальной культуры E. coli Dh5α, проявлялась в концентрации 0,74 ммоль/л. Что касается катионного пептида АВ-18, то он проявлял бактерицидную активность в отношении выбранного штамма уже в концентрации 0,15 ммоль/л. Таким образом, минимальная бактерицидная концентрация для АВ-18 превосходила таковую положительного контроля в 5 раз. Следует отметить, что ингибирование роста бактериального штамма, разведённого в 10 раз, наблюдалось уже под действием 0,03 ммоль/л АВ-18, при этом антибиотик подавлял рост разведённой в 100 раз бактериальной культуры только в концентрации 0,15 ммоль/л.

 

Рис. 1. Интенсивность роста колоний E. coli Dh5α под воздействием пептида AB-18.

Fig. 1. Growth intensity of E. coli Dh5α colonies under the influence of AB-18.

 

Минимальная бактерицидная концентрация для AB-17 составляла 0,74 ммоль/л, что сопоставимо с активностью антибиотика. При этом на рис. 2 видно, что подавление активности роста бактериальной культуры под действием АВ-17 в концентрации 0,15 ммоль/л происходит при разведении E. coli Dh5α в 10 раз, а при обработке ампициллином в той же концентрации ― только при разведении культуры в 100 раз. Таким образом, антибактериальная активность пептида AB-17 в целом была выше таковой у положительного контроля.

 

Рис. 2. Интенсивность роста колоний E. coli Dh5α под воздействием пептида AB-17.

Fig. 2. Growth intensity of E. coli Dh5α colonies under the influence of AB-17.

 

В рамках проведённых исследований бактерицидной активности разработанных нами катионных пептидов большой интерес представляет пептид AB-14, который демонстрировал высокую бактерицидную активность в отношении E. coli Dh5α (рис. 3). Катионный пептид АВ-14 проявлял бактерицидную активность в отношении выбранного штамма уже в концентрации 0,03 ммоль/л. Таким образом, минимальная бактерицидная концентрация для АВ-14 превосходила таковую положительного контроля в 25 раз с сохранением указанной разницы даже при больших разведениях бактериальной культуры (1:10 000 и 1:100 000). Интересно отметить, что заряд данного пептида составлял +8, в то время как заряд представленных выше менее активных пептидов был либо таким же, либо выше. Данное наблюдение свидетельствует об отсутствии корреляции заряда пептида с его антибактериальной активностью.

 

Рис. 3. Интенсивность роста колоний E. coli Dh5α под воздействием пептида AB-14.

Fig. 3. Growth intensity of E. coli Dh5α colonies under the influence of AB-14.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В рамках проведённого исследования нами был получен спектр пептидных соединений, обладающих антибактериальной активностью. Активные катионные пептиды имели положительный заряд от +8 до +16 и молекулярную массу 2–2,7 кДа, что указывает на их относительно небольшой размер. Чёткой корреляции между величиной заряда и активностью выявлено не было, однако было показано, что активность трёх разработанных пептидов была либо сопоставима с антибиотиком ампициллином, либо превышала последний по бактерицидности. Так, например, самым активным катионным пептидом был АВ-14, минимальная бактерицидная концентрация которого была в 25 раз меньше таковой ампициллина.

Обсуждение основного результата исследования

КАМП считаются перспективным кандидатом на роль ведущих антибактериальных препаратов, однако они имеют некоторые ограничения для широкого применения в клинической практике. Пептиды данной группы обычно нестабильны и легко подвергаются ферментативному расщеплению как in vitro, так и in vivo, в то время как некоторые из них обладают токсичностью и гемолитической активностью. Кроме того, имеются определённые сложности синтеза катионных пептидов [34]. Таким образом, поиск и конструирование новых эффективных КАМП является весьма трудоёмкой задачей.

Информация, представленная в современных базах данных, позволяет прогнозировать свойства и создавать пептидные последовательности разнообразного дизайна [35]. Известные подходы к выявлению потенциально полезных КАМП, такие как структурная модификация известных природных пептидов, компьютерный скрининг, позволяют значительно сократить время и стоимость разработки новых антибактериальных пептидных структур [36–40].

В большинстве случаев за антибактериальную активность КАМП природного происхождения отвечают лишь несколько аминокислот. Однако количество природных пептидов, вероятно, исчисляется миллионами [41], что требует новых подходов для облегчения обнаружения и разработки новых соединений. В частности, всё более важную роль в исследованиях КАМП играют вычислительные методы, при этом традиционные методы машинного обучения считаются эффективными для распознавания ранее неизвестных пептидов. Вероятнее всего, на основе результатов наших исследований, анализируя структуры активных пептидов АВ-14, АВ-17 и АВ-18, мы можем предположить, что наиболее оптимальными структурами, обладающими антибактериальными свойствами, будут являться амфифильные альфа-спиральные пептиды.

Широко используемой стратегией для повышения устойчивости КАМП к расщеплению протеазами является замещение остатков L-аминокислот на D-аминокислоты. Данный метод стал возможным, поскольку протеазы человека и микроорганизмов распознают исключительно L-аминокислоты, игнорируя неприродные D-формы. Следовательно, в некоторых случаях подобное замещение может увеличить период действия КАМП, чего может быть достаточно для достижения минимальных ингибирующих концентраций. Так, J. Lu с соавт. [36] синтезировали пептиды, сконструированные на основе Pep05 посредством изменения конфигурации аминокислот последовательности, что привело к повышению активности, увеличению периода действия и снижению токсичности полученных молекул. Важно отметить, что с целью изменения величины заряда и гидрофобности аминокислоты могут быть заменены на другие без изменения конфигурации, и данный подход остаётся не менее популярным и успешным в исследовательской практике.

Укорачивание пептидной последовательности ― часто используемый метод, направленный на улучшение биологической активности соединения, и способный исключить из цепи фрагменты, которые могут действовать как потенциальный антиген. В то же время удаление важного участка аминокислотной последовательности, напротив, может снижать антимикробную активность. На примере мощного катионного пептида буфорина 2, состоящего из 21 аминокислоты, C.B. Park и соавт. [42] показали, что удаление четырёх аминокислотных остатков (TRSS) c N-конца способно увеличить антибактериальную активность пептида, в то время как удаление четырёх аминокислотных остатков (LLRK) с С-конца приводило к полной потере противомикробных свойств.

Ещё одним подходом в рамках разработки пептидных конструкций является терминальное ацетилирование и амидирование пептидов, которое может способствовать увеличению спиральности пептида, предотвращая ферментативную деградацию и повышая структурную стабильность и антимикробную активность. В публикации D. Li и соавт. [43] описано, что сконструированный путём ацетилирования по N-концу аналог L163 показал более высокую устойчивость к деградации трипсином. В другом исследовании С-концевое амидирование аналогов пептида эскулентина 2 способствовало увеличению их противомикробной активности и повышению селективности [44].

Помимо упомянутых выше методов, исследуются и применяются на практике и другие структурные модификации. Сшивание боковых цепей пептида одним или несколькими внешними связывающими мостиками с целью стабилизации спирали и циклизация пептидных последовательностей также увеличивают антимикробную активность и посредством сокрытия протеолитических мишеней повышают устойчивость к протеазам. Успешное использование данного подхода описывается на примере пептидов ― производных магайнина 2, α-спирального природного КАМП, обнаруженного в коже африканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Антимикробная активность магайнина 2 сильно зависит от его амфипатичности и спиральной структуры, однако большая молекулярная масса и меньшая химическая стабильность внутри и вне клеточной среды препятствуют его потенциальному применению [45]. Другой эффективный метод разработки пептидов заключается в разветвлении пептидных цепей с получением дендримерных пептидных конструкций, что приводит к повышению взаимодействия с мембраной клетки за счёт кооперативных эффектов. Так, например, структуры пептидов АВ-17 и АВ-18 схожи по аминокислотному составу, однако введение разветвления по N-концу последовательности пептида АВ-18 (Arg-Arg) приводит к повышению антибактериальной активности в 5 раз.

Таким образом, для проведения данного исследования мы создавали дизайн катионных пептидов, ориентируясь на содержание гидрофобных и положительно заряженных аминокислот, стремясь получить амфифильные структуры, близкие к α-спиральным. Получение целого спектра активных пептидов даёт нам основание полагать, что выбор критериев для конструирования пептидных соединений был верным.

Природные КАМП участвуют в поддержании здорового микробиома кожи посредством модуляции состава микробиоты, её пролиферации и гибели. Вырабатываемые в эпидермисе, главным образом в кератиноцитах, КАМП не только проявляют антибактериальную активность, но и оказывают иммуномодулирующее действие [46]. Было показано, что нарушение выработки или активности КАМП вносит значительный вклад в повышенную восприимчивость пациентов с АтД к кожным инфекциям, вызываемым грибками, бактериями и вирусами, и таким образом воспринимаются как важный фактор в патофизиологии АтД [47].

Ключевыми аспектами патогенеза АтД являются длительно персистирующее воспаление и нарушение функции эпидермального барьера. Известно, что у пациентов с АтД отмечается снижение разнообразия микробиома кожи за счёт преобладания в микробиоме Staphylococcus spp., преимущественно S. aureus и S. epidermidis, особенно при обострении заболевания [48–52]. S. aureus играет важную роль в патогенезе АтД, являясь фактором обострения и развития осложнений. Нарушение барьерной функции кожи зачастую приводит к колонизации S. aureus при АтД. Известно также, что пациенты с псориазом, у которых также нарушен кожный барьер, гораздо более устойчивы к кожным инфекциям [53]. В настоящее время считается, что цитокиновая среда у пациентов с атопией также играет значительную роль в снижении экспрессии антимикробных пептидов. P.Y. Ong и соавт. [54] первыми выявили дефицит катионных пептидов LL-37 и HBD-2 в коже пациентов с острым и хроническим АтД, чего не наблюдалось при псориатических поражениях. Известно, что для АтД характерен Th2-направленный цитокиновый паттерн с высоким уровнем IgE и эозинофилией, а также сверхэкспрессией IL-4, IL-10 и IL-13. Высокие уровни IL-4 и IL-13 ингибируют HBD-2 и HBD-3 [55]. IL-4 и IL-13 действуют непосредственно на кератиноциты, подавляя экспрессию HBD-3 и LL-37 посредством активации STAT-6, который ингибирует систему TNF-α/NF-kB. В то же время β-дефензины и LL-37 рекрутируют лейкоциты, что и приводит к выработке IL-4, IL-13 и IL-31 ― основных интерлейкинов, участвующих в развитии АтД, создавая таким образом идеальную воспалительную среду для патогенеза заболевания [56]. Поскольку LL-37, HBD-2 и HBD-3 обладают антистафилококковой активностью, это наблюдаемое снижение уровня экспрессии антимикробных пептидов считается важной предпосылкой стафилококковой колонизации и инфекций у атопических субъектов.

При АтД показана также важная роль грибковой инфекции, особенно Malassezia spp. и Candida spp. Антигены Malassezia spp. активируют кератиноциты, клетки Лангерганса, дендритные клетки, естественные киллеры и фибробласты, стимулируют выработку специфических IgE через Т-клеточно-опосредованную стимуляцию В-клеток [57–60]. Таким образом, роль грибов Malassezia spp. и Candida spp., а также S. aureus в патогенезе АтД очень важна: с одной стороны, они усугубляют тяжесть заболевания, приводя к вторичному инфицированию, с другой ― являются важнейшим сенсибилизирующим агентом, что доказано присутствием аллергенспецифических IgE к их антигенам.

Очевидно, что АтД приводит как к значительной потере качества жизни, так и необходимости пожизненного лечения, препараты для которого могут иметь побочные эффекты. Наружная терапия топическими кортикостероидами и топическими ингибиторами кальциневрина эффективна для уменьшения признаков воспаления кожи и зуда, однако не оказывает значимого клинического эффекта в отношении вторичной инфекции, что, возможно, объясняет высокий риск рецидивов заболевания и тенденцию к хроническому течению. В таких случаях назначают комбинированные наружные препараты, оказывающие терапевтическое действие в отношении микробной флоры, которые, к сожалению, не всегда эффективны в связи с возможностью формирования резистентности. Следует отметить, что в последние годы исследования в данной области были сосредоточены на изучении КАМП не только как альтернативы противомикробным препаратам, но и в качестве фармацевтических средств иммуномодулирующего действия [61].

Таким образом, применение катионных пептидов для терапии бактериальных осложнений при АтД является перспективным направлением исследований, которые станут важным этапом в создании новых препаратов для наружной терапии, в том числе АтД.

Ограничения исследования

Для применения КАМП в клинической практике необходимо повышать их протеолитическую устойчивость. На следующем этапе исследований мы планируем создать комплексные соединения на основе активных катионных пептидов и фуллерена С60, который будет выполнять роль биологически активной платформы, защищающей пептиды от протеолиза. Важным аспектом создания комплексов будет обязательное сохранение биологической активности каждого из компонентов, поскольку структуры и свойства пептидных молекул и молекулы фуллерена С60 могут меняться при комплексообразовании.

В данном исследовании не изучали эффективность КАМП при АтД, однако экспериментальные данные, свидетельствующие об их антибактериальной эффективности, позволяют обосновать перспективу их применения в терапии бактериальных осложнений при АтД.

Ранее авторами на модели АтД была показана противоаллергическая активность водного раствора фуллерена, целесообразно проведение подобных исследований и в отношении КАМП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка новых препаратов для терапии бактериальных осложнений, в том числе аллергического воспаления, является актуальной задачей в сегодняшней ситуации снижения эффективности имеющихся антибиотиков. Перспективным направлением в данной области исследований является создание антибактериальных препаратов на основе катионных пептидов. В рамках проведённых исследований нами были разработаны и синтезированы три активных антибактериальных катионных пептида ― АВ-14, АВ-17 и АВ-18, которые проявили выраженную бактерицидную активность и имеют высокий потенциал практического применения. На основе этих пептидов мы планируем разрабатывать комплексные соединения, протеолитическая устойчивость которых будет достигаться путём использования фуллерена С60. Данные соединения должны будут обладать рядом биологических активностей, в том числе противовоспалительной, противоаллергической и антибактериальной. По нашему мнению, эти комплексные соединения станут перспективными для терапии воспалительных заболеваний кожи, в том числе АтД, осложнённых бактериальной инфекцией.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены при поддержке Федерального медико- биологического агентства (субсидия на выполнение государственного задания «Фуллерен-21»).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведённым исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.А. Галкина ― постановка методики, лабораторные исследования, написание текста статьи; Д.К. Болякина, А.В. Шатилова, А.А. Шатилов, М.О. Бабихина, А.А. Никонова ― лабораторные исследования; А.К. Голомидова ― постановка методики; Д.А. Кудлай ― консультация по исследованию, Н.Н. Шершакова ― постановка методики, концепция исследования, написание текста статьи, научное руководство; С.М. Андреев ― постановка методики, концепция исследования, научное руководство; М.Р. Хаитов ― концепция исследования, научное руководство.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This work was supported by the Federal Medical-Biological Agency (the subsidy for the state task "Fullerene-21").

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. A.A. Galkina ― carried out the experiment, summarized its results and wrote this manuscript; D.K. Bolyakina, A.V. Shatilova, A.A. Shatilov, M.O. Babikhina, A.A. Nikonova ― laboratory research; A.K. Golomidova ― method setting; D.A. Kudlay ― consultation; N.N. Shershakova ― method setting, research concept, oversaw the project and wrote this manuscript; S.M. Andreev ― method setting, research concept, oversaw the project; M.R. Khaitov ― research concept, oversaw the project.

About the authors

Anastasia A. Galkina

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: anastasia.a.galkina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4521-0813
SPIN-code: 7329-0197
Russian Federation, Moscow

Darya K. Bolyakina

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: bolyakina.dasha@gmail.com
ORCID iD: 0009-0006-2223-1514
Russian Federation, Moscow

Anastasia V. Shatilova

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: av.timofeeva@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0003-3780-2878
SPIN-code: 1988-1536
Russian Federation, Moscow

Artem A. Shatilov

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: aa.shatilov@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0002-4675-8074
SPIN-code: 6768-5796
Russian Federation, Moscow

Marina O. Babikhina

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: mbabihina@gmail.com
ORCID iD: 0009-0000-5935-1647
SPIN-code: 4621-0268
Russian Federation, Moscow

Alla K. Golomidova

Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences

Email: alla_golomidova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9893-0270
SPIN-code: 9954-3759

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Alexandra A. Nikonova

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0001-9610-0935
SPIN-code: 1950-5594

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Sergey M. Andreev

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: andsergej@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8297-579X
SPIN-code: 2542-5260

Cand. Sci. (Chem.)

Russian Federation, Moscow

Dmitry A. Kudlay

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: D624254@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1878-4467
SPIN-code: 4129-7880

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Nadezda N. Shershakova

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia

Email: nn.shershakova@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0001-6444-6499
SPIN-code: 7555-5925

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Musa R. Khaitov

National Research Center ― Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia; The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Author for correspondence.
Email: mr.khaitov@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0003-4961-9640
SPIN-code: 3199-9803

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding member of the Russian Academy of Sciences

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files