Actual questions of standardization of water-salt extracts of mixed allergens from house dust mites intended for medicinal forms of sublingual immunotherapy

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Успех аллергенспецифической иммунотерапии во многом зависит от высокой степени очистки и правильно подобранной дозы белковых компонентов, находящихся в готовой форме лечебного аллергена [1]. Ранее показано, что на аллергенность клещевых экстрактов влияют количество и состав примесей в среде их обитания, соблюдение технологии производства и способов хранения, срок изготовления и др. [1, 2]. Применение физико-химических, химических и иммунобиологических методов исследования для анализа качества водно-солевого клещевого экстракта, предназначенного для получения готовой формы лечебного аллергена, является необходимым условием процесса стандартизации лечебного препарата. Последнее, в свою очередь, гарантирует клиническую эффективность и безопасность аллергенспецифической иммунотерапии [1, 3].

Стандартизацию аллергенов проводят внутри живого организма (in vivo) и в лабораторных (in vitro) условиях [4]. Стандартизация in vivo осуществляется кожными или внутрикожными тестами [4, 5]. Некоторые методы, предназначенные для стандартизации аллергенов in vitro, такие как определение единиц белкового азота и количества белка в экстракте, используются с 70-х годов ХХ века и уже доказали свою эффективность [1].

На современном этапе для определения специфичности (подлинности) экстракта рекомендуется применять иммунологические методы, и прежде всего иммуноферментный анализ [4, 6]. Определение подлинности исходного водно-солевого экстракта требует стандартизированного нативного референс-аллергена (для сравнения) и референс-сыворотки для иммуноферментного анализа [1].

Существуют также стандартные тест-системы, которые позволяют определить содержание основных аллергенов в экстрактах [4]. Стандартизация основных аллергенов требует надёжных контрольных референс-аллергенов, изготовленных из рекомбинантных аллергенов и стандартных наборов для иммуноферментного анализа на основе иммуносорбентов (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) [6].

В лаборатории по разработке аллергенов НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова создана технология получения гранулированной формы микст-аллергена из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) и Dermatophagoides farinae (Der f) [7]. Основой для её изготовления является водно-солевой экстракт из клещей Der p и Der f и сред их культивирования в соотношении 1:1 [8]. Данный экстракт по технологии приготовления отличается от классического, так как основное экстрагирование клещей проводится без применения консерванта (фенола), что обеспечивает его бÓльшую безопасность. Для увеличения длительности хранения полученного маточного раствора его лиофильно высушивают. Доклинические испытания экстракта из клещей Der p и Der f показали отсутствие токсичности, высокую аллергенную и иммуногенную активность. Однако для соблюдения требований подлинности аллергена, регламентированных в общей фармакопейной статье ОФС.1.7.2.0034.15¹ Государственной фармакопеи Российской Федерации, необходимо проведение дополнительных исследований [4, 7, 8].

Цель ― определение подлинности бесфенольного водно-солевого экстракта микст-аллергена из клещей Der p и Der f, предназначенного для лечебной формы препарата.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Стандартизация полученного экстракта микст-аллергена и стандартного аллергена происходила по единицам белкового азота (метод Несслера)²; количество белка в искомом экстракте и нативном стандартном аллергене определяли методом Бредфорда [4]. Стандартная кривая для метода Бредфорда находилась в диапазоне от 1 до 25 мкг/мл по бычьему сывороточному альбумину (Bio-Rad, США). Наличие аллергокомпонентов в микст-аллергене изучали с помощью разработанного в 1970 году У.К. Лэммли (Ulrich K. Laemmli) электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)³. Величину рН определяли потенциометрическим методом [4]. Исследованы четыре серии препарата.

Сравнение специфической активности стандартного аллергена и экспериментального микст-аллергена проводили методом реверсивного иммуноанализа (reversible allergosorbent test, REAST), который заключается в следующем. В лунках полистиролового планшета сорбированы моноклональные антитела к иммуноглобулинам Е (IgE) человека, в которые вносят образцы референс-сывороток в стандартных концентрациях, содержащие специфические IgE к стандартному аллергену, стандартные положительные и отрицательные контроли. К образовавшемуся в лунке планшета комплексу IgE–анти-IgE добавляют аллергены, меченные биотином. Конъюгат ― стрептавидин-пероксидаза хрена. В лунках планшета с положительной реакцией проявляется цветное окрашивание. Метод исключает перекрёстные неспецифические реакции с иммуноглобулинами других классов (A, G, M, D), в результате чего исключается получение ложноотрицательных результатов⁴.

Для сравнения специфической активности водно-солевого экстракта микст-аллергена из клещей Der p и Der f использовали биотинилированный нативный стандартизированный аллерген Der p (Dr. Fooke, Германия) и референс-сыворотки к Der p, входящие в тест-систему и соответствующие 1-му (0,35 МЕ/мл), 2-му (0,7 МЕ/мл), 3-му (3,5 МЕ/мл) и 4-му (17,5 МЕ/мл) классам. Референс-сыворотку к Der p 3-го класса также использовали в реакции с водно-солевым экстрактом микст-аллергена, что делает результат исследования более достоверным.

Для сравнения специфической активности экспериментального аллергена по белковым фракциям клеща Der f, содержащегося в нём, использовали сыворотки пациентов, подобранные с помощью метода RIDA AllergyScreen (R-Biopharm AG, Германия)⁵. Подбирали сыворотки с установленной степенью активности (3-й класс), что соответствует содержанию специфических IgE 3,50–17,49 МЕ/мл.

Оптическую плотность растворов в лунках планшета оценивали фотометрическим методом на лабораторном фотометре STAT FAX 2100 (Awareness Technology, США) на длине волны Δ 450/630 нм.

Поскольку тест требует биотинилирования антигена, конъюгацию микст-аллергена с биотином проводили по протоколу биотинилирования белков, в основном по остаткам лизина, используя набор для биотинилирования антител (белков) фирмы ООО «Силекс» (Россия)⁶.

Использована стандартная схема заполнения планшета согласно ОФС.1.7.2.0034.15 [4] с небольшими модификациями (табл. 1).

 

Таблица 1. Схема заполнения планшета / Table 1. Filling scheme of the plate

	1	2	3	4
А	ПК	АР	CР	CF
В	ПК	АР	CР	CF
С	ОК1	ВР	CР	CF
D	ОК1	ВР	CР	CF
E	КК	СР	СР	CF
F	КК	СР	СР	CF
G	KK	DР	ОК2	ОК2
H	KK	DР	ОК2	ОК2
Вносимые аллергены / Концентрация	Стандартный аллерген /	Стандартный аллерген /	Микст-аллерген /	Микст-аллерген /

Примечание. КК ― контроль конъюгата (в лунку вместо сыворотки внесён разводящий раствор; результат должен быть отрицательным); АР ― референс-сыворотки к Der p (0,35 МЕ/мл); ВР ― референс-сыворотки к Der p (0,7 МЕ/мл); CР ― референс-сыворотки к Der p (3,5 МЕ/мл); DР ― референс-сыворотки к Der p (17,5 МЕ/мл); CF ― (3-й класс) референс-сыворотки к Der f; ПК ― положительный контроль (в соответствии с тест-системой); ОК1 ― отрицательный контроль (в соответствии с тест-системой); ОК2 ― отрицательный контроль с сывороткой здоровых доноров.

Note: КК ― conjugate control (A diluting solution was introduced into the holes instead of serum. The result should be negative); АР ― reference serum to Der p (0,35 IU/ml); ВР ― reference serum to Der p (0,7 IU/ml); CР ― reference serum to Der p (3,5 IU/ml); DР ― reference serum to Der p (17,5 IU/ml); CF ― reference serum to Der f; ПК ― Positive Control (according to the test system); ОК1 ― Negative Control (according to the test system); ОК2 ― Negative Control with serum from healthy donors.

 

Критерии соответствия

Соотношение биотина в стандартном аллергене и микст-аллергене Der p и Der f проверяли по уровню связывания с конъюгатом. На нитроцеллюлозную мембрану Immobilon PVDF (Merck Millipore, Германия) были нанесены (1) стандартный биотинилированный аллерген Der p (концентрация белка 1 мкг/мл); (2) биотинилированный микст-аллерген из клещей Der p и Der f (концентрация белка 1 мкг/мл); (3) микст-аллерген из клещей Der p и Der f (концентрация белка 1 мкг/мл) в качестве отрицательного контроля. Затем наносили конъюгат ― стрептавидин-пероксидазу хрена. После отмывания ― ТМБ-субстрат (система тетраметилбензидин). Результаты оценивали визуально по интенсивности голубого окрашивания. К исследованию допускался лишь тот биотинилированный микст-аллерген Der p и Der f, который на нитроцеллюлозной мембране визуально давал одинаковое со стандартным аллергеном окрашивание.

Условия проведения

Исследование проведено в лаборатории по разработке аллергенов Научно-исследовательского института вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова (Москва) совместно с центром коллективного пользования.

Статистический анализ

Принципы расчёта размера выборки: исследование проводили на четырёх сериях препарата.

Методы статистического анализа данных: результаты обрабатывали с помощью пакета прикладных статистических программ Microsoft Excel, версия 2010, с анализом количественных признаков. Вычисляли следующие величины: выборочное среднее (x-), выборочное стандартное отклонение (s), стандартную ошибку среднего (s_x₋). Достоверность различий между более чем двумя группами изучали с помощью 95% доверительного интервала для среднего (95% ДИ). Критической величиной уровня значимости считали α=0,05, где α — это максимально приемлемая вероятность ошибочно признать существование различий там, где их нет [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследуемый водно-солевой экстракт микст-аллергена Der p и Der f представляет собой прозрачную жидкость с характерным пигментным окрашиванием светло-коричневого цвета без видимых включений и осадка. Исходная величина белкового азота в исследуемом микст-аллергене ― 40 000±10 000 PNU; в стандартном аллергене ― 800 000 PNU. Исходная концентрация белка в микст-аллергене ― 4,8 мг/мл, в стандартном аллергене ― 10 мг/мл. pH микст-аллергена ― 7,0±0,25.

SDS-PAGE по Лэммли

SDS-PAGE по Лэммли показал сохранение белкового профиля водно-солевого экстракта микст-аллергена Der p и Der f, соответствующего белковому профилю аллергенов клещей домашней пыли, представленному в литературе [10]. Отмечается высокое содержание белковых фракций с молекулярной массой ниже 14 kDa, что может соответствовать пептидным фрагментам белка (рис. 1). Фрагментированные молекулы аллергена, возможно, могут реже вызывать анафилактические реакции при сублингвальной иммунотерапии из-за потери части своих IgE-связывающих эпитопов [11]. Можно также отметить большое разнообразие белков, присутствующих в клещевом аллергене.

 

Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по Лэммли. Примечание. 1 ― белковые стандарты; 2 ― водно-солевой экстракт микст-аллергена Der p и Der f (концентрация белка 0,171 мг/мл). / Fig. 1. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) by Laemmli. Note: 1 ― Protein standards; 2 ― Water-salt extract of mixed allergen Der p and Der f (protein concentration 0.171 mg/ml).

 

Определение подлинности

Сравнение специфической активности стандартного аллергена и экспериментального микст-аллергена проводили методом реверсивного иммуноанализа (REAST). Для сравнения специфической активности водно-солевого экстракта микст-аллергена из клещей Der p и Der f использовали референс-систему, состоящую из биотинилированного нативного стандартизированного аллергена Der p и референс-сывороток, содержащих IgE к Der p или Der f. Репрезентативную прямую положительной корреляционной зависимости оптической плотности от концентрации белковых компонентов экстракта микст-аллергена Der p и Der f устанавливали методом подбора. Показано, что для получения положительной корреляционной зависимости оптической плотности от концентрации антигена необходимо применение высокотитражной сыворотки (3-й класс) и аллергена с содержанием белкового азота 1000–5000 PNU для Der p и 1000–8000 PNU для Der f (рис. 2). Исходя из полученных результатов, экспериментальный микст-аллерген Der p и Der f был введён в референс-систему (Dr. Fooke, Германия). Сравнительный анализ стандартного аллергена и исследуемого микст-аллергена проводили на референс-сыворотках 3-го класса, при этом концентрации вводимого в тест-систему стандартного и микст-аллергена существенно не отличались.

 

Рис. 2. Зависимость оптической плотности от концентрации белка в микст-аллергене Der p и Der f в REAST-тесте с референс-сыворотками, содержащими IgE-антитела к Der p или Der f (3,5 МЕ/мл). Примечание. По оси ординат отображена оптическая плотность вещества в лунках планшета (длина волны Δ 450/630 нм); по оси абсцисс ― концентрация белкового азота в экспериментальном микст-аллергене клещей домашней пыли Der p и Der f (PNU). / Fig. 2. The dependence of the optical density on the protein concentration in the mixed allergen Der p and Der f in a REAST test with reference serums containing IgE antibodies to Der p or Der f (3.5 IU/ml). Note: The optical density of the substance in the holes of the plate is displayed along the ordinate axis (wavelength Δ 450/630 nm); along the abscissa axis is the concentration of protein nitrogen in the experimental mix-allergen of house dust mites Der p and Def (PNU).

 

По результатам исследования выявлено, что статистически значимых отличий оптической плотности исследуемого аллергена (во всех четырёх сериях препарата) в REAST с референс-сыворотками (n=6), содержащими специфические IgE к Der p, и оптической плотности при реакции стандартного аллергена с референс-сывороткой 3-го класса (n=8) нет (р >0,05). Аналогично оптическая плотность водно-солевого экстракта микст-аллергена Der p и Der f в реакции с референс-сывороткой, содержащей специфические IgE к Der f (n=6), не имеет статистически значимых отличий от оптической плотности 3-го класса в реакции стандартного аллергена и референс-сыворотки (р >0,05). Таким образом, всё вышеизложенное в соответствии с ОФС.1.7.2.0034.15 является подтверждением подлинности препарата (табл. 2, 3).

 

Таблица 2. Оптическая плотность в REAST-тесте (стандартный аллерген и референс-сыворотки) / Table 2. The optical density in the REAST test (standard allergen and serum reference)

Концентрация специфических IgE (МЕ/мл) / Класс сывороток	n	Выборочное среднее, x-	Выборочное стандартное отклонение, s	Стандартная ошибка среднего, sx₋	95% доверительный интервал*
0,35/1	8	0,106	0,038	0,013	от 0,074–0,138
0,7/2	8	0,161	0,057	0,02	от 0,113–0,208
3,5/3	8	0,932	0,182	0,064	от 0,784–1,08
17,5/4	8	1,619	0,581	0,205	от 1,133–2,105

Примечание. * α=0,05, критическое значение t=2,365, при числе степеней свободы ν=(n-1)=7.

Note: * α=0,05, the critical value of t=2,365, with the number of degrees of freedom ν=(n-1)=7.

 

Таблица 3. Оптическая плотность в REAST-тесте различных серий водно-солевого экстракта микст-аллергена Der p и Der f с референс-сыворотками, содержащими IgE-антитела к Der p или Der f (3,5 МЕ/мл) / Table 3. The optical density in the REAST test of various series of water-salt extract of mixed allergen Der p and Def with reference serums containing IgE antibodies to Der p or Der f (3.5 IU/ml)

Серия	n	Выборочное среднее, x-	Выборочное стандартное отклонение, s	Стандартная ошибка среднего, sx₋	95% доверительный интервал*
Реакция с референс-сывороткой к Der p
1	6	0,61	0,2	0,07	от 0,428–0,792
2	6	1,1	0,137	0,048	от 0,976–1,225
3	6	0,844	0,18	0,064	от 0,68–1,001
4	6	0,91	0,167	0,059	от 0,758–1,06
Реакция с референс-сывороткой к Der f
1	6	0,624	0,214	0,075	от 0,429–0,819
2	6	0,809	0,26	0,091	от 0,573–1,045
3	6	0,901	0,168	0,059	от 0,748–1,05
4	6	0,692	0,24	0,084	от 0,474–0,91

Примечание. * α=0,05, t=2,571, при v=2(n-1)=5.

Note: * α=0.05, t=2.571, at v=2(n-1)=5.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В иммунологии под специфичностью понимают избирательность взаимодействия индукторов и продуктов иммунных процессов, в частности антигенов и антител [12]. Именно поэтому чтобы доказать подлинность аллергена, необходимы, прежде всего, строго специфичные к данному аллергену референс-сыворотки. Согласно ОФС.1.7.2.0034.15, сравнение изучаемого аллергена надо проводить с референс-аллергеном и референс-сыворотками [4].

До 90-х годов XX века в России и за рубежом препараты аллергенов были стандартизованы по содержанию белка и тестировались in vivo (кожные пробы) на пациентах, чувствительных к исследуемому аллергену, поскольку количество белка не всегда коррелирует с его аллергенной активностью. С целью стандартизации методов оценки активности препаратов аллергенов и перехода на использование методов in vitro была предпринята попытка по созданию международных стандартных образцов, в результате которой получены 5 нативных экстрактов референс-аллергенов и 2 стандартных образца главных аллергенов. Разработанные стандартные образцы рекомендованы для сравнения препаратов от разных производителей, а также разных серий одной фирмы [2, 6].

В настоящее время в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (правопреемник Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича) продолжается работа по созданию стандартных образцов для оценки биологической активности препаратов аллергенов. В Российской Федерации для клещей домашней пыли, к сожалению, референс-аллергены ещё не разработаны [6], что усложняет решение задачи по определению подлинности экспериментального микст-аллергена Der p и Der f. В результате для её реализации была взята за образец зарегистрированная в Российской Федерации полностью стандартная диагностическая референс-система, которая содержит как стандартный нативный экстракт аллергена Der p, так и референс-сыворотки к нему. Вводя экспериментальный микст-аллерген Der p и Der f в данную референс-систему, мы наиболее приближаемся к решению задачи его подлинности. Поскольку аллергенные экстракты Der p и Der f сопоставимы по физико-химическим и биологическим свойствам исходного материала, также возможно сравнение специфической Der f-активности исследуемого микст-аллергена с использованием соответствующих специфических к Der f сывороток [6].

Обсуждение основного результата исследования

Поскольку водно-солевой экстракт аллергена (тем более микст-аллерген) — это многокомпонентная смесь, содержащая пептиды, гликопротеиды, полисахариды, производные липидов, энзимы, пигменты и другие минорные примеси [13], то данному экстракту могут быть свойственны определённые матричные эффекты [14]. Возможное объяснение связано с агрегационным состоянием аллергена в различных его разведениях, что может привести к завышенной оценке, если эпитопы свободны, или к заниженной ― если эпитопы связаны. Следовательно, прямое сравнение аллергенов в иммуноферментном анализе не всегда отражает или предсказывает реальное содержание в них аллергенных компонентов. Проблема завышения содержания аллергена методами ELISA описана в исследованиях некоторых авторов [10]. Так, при исследовании качества аллергенов клещей домашней пыли европейских компаний отмечено, что в предназначенном для стандартизации нативных аллергенов тесте ELISA (с моноклональными сыворотками и рекомбинантным белком) количество измеренного основного аллергена Der f1 явно завышено и превышает общее содержание белка в образцах. Действительно, наиболее достоверную репрезентативную кривую положительной корреляционной зависимости оптической плотности от концентрации белков в микст-аллергене Der p и Der f нам пришлось подбирать. Возможно, предлагаемые в ОФС.1.7.2.0034.15 условия определения подлинности в иммуноферментном анализе могут подойти не для каждой белковой смеси исследуемых аллергенов.

Резюме основного результата исследования

Проведённое исследование доказывает подлинность бесфенольного водно-солевого экстракта микст-аллергена из клещей Der p и Der f, предназначенного для лечебных форм сублингвальной иммунотерапии, поскольку продемонстрировано активное связывание со строго специфическими IgE к Der p и Der f.

Ограничения исследования

Сравнительный анализ специфической активности нам представляется малоинформативным, так как отсутствует российский референс-аллерген к Der p и Der f, а сравнение с имеющимися в наличии пыльцевыми референс-аллергенами нецелесообразно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подлинность бесфенольного водно-солевого экстракта микст-аллергена из клещей Der p и Der f, предназначенного для лечебных форм сублингвальной иммунотерапии, доказана.

Бесфенольное экстрагирование и последующее лиофильное высушивание не повлияли на основные аллергенные компоненты микст-аллергена Der p и Der f и позволили ему сохранить высокую степень специфичности.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Настоящая статья подготовлена при поддержке Правительства Российской Федерации в рамках исполнения государственного задания «Разработка нативных и молекулярных форм аллергенов, предназначенных для диагностики и лечения аллергических заболеваний в педиатрической практике» в НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова (Москва, Россия).

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Вклад авторов. С.Ю. Петрова, С.В. Хлгатян ― концепция и дизайн исследования; Л.Н. Нестеренко, С.Ю. Петрова, П.В. Самойликов ― сбор и обработка материала; С.Ю. Петрова, В.М. Бержец, Н.С. Петрова, А.В. Васильева ― анализ полученных данных и написание текста. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Благодарности. Благодарим руководство центра коллективного пользования НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова (Москва, Россия) за оказанную организационную поддержку.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This article was prepared with the support of the Government of the Russian Federation within the framework of the state task “Development of native and molecular forms of allergens intended for the diagnosis and treatment of allergic diseases in pediatric practice” at Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Moscow, Russian Federation).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. S.Yu. Petrova, S.V. Khlgatian ― concept and design of the study; L.N. Nesterenko, S.Yu. Petrova, P.V. Samoylikov ― collecting and processing of the material; S.Yu. Petrova, V.M. Berzhets, N.S. Petrova, A.V. Vasilyeva ― analysis of the data obtained and writing the text. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Acknowledgments. We thank the management of the Center for Collective Use of Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Moscow, Russian Federation) for the organizational support provided.

 

¹ Фармакопея.рф. ОФС.1.7.2.0034.15 Определение подлинности препаратов аллергенов. Режим доступа: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-2-0034-15-opredelenie-podlinnosti-preparatov-allergenov/. Дата обращения: 03.12.2021.

² Фармакопея.рф. ОФС.1.7.2.0026.15. Определение белкового азота с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала в иммунобиологических лекарственных препаратах. Режим доступа: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-2-0026-15-opredelenie-belkovogo-azota-s-reaktivom-nesslera-s-predvaritelnym-osazhdeniem-belkovogo-materiala-v-immunobiologicheskih-lekarstvennyh-preparatah/. Дата обращения: 03.12.2021.

³ Фармакопея.рф. ОФС.1.2.1.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле. Режим доступа: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-1-0023-15-elektroforez-v-poliakrilamidnom-gele/. Дата обращения: 03.12.2021.

⁴ Инструкция по применению наборов реагентов для количественного иммуноферментного определения концентраций аллерген-специфических IgE в сыворотке (плазме) крови с биотинилированными жидкофазными экстрактами аллергенов, рекомбинантными и высоко очищенными нативными аллергенами. Режим доступа: http://fooke.ru/upload/iblock/cb1/Instructions sIgE REAST with Biotinylated-Recombinant Allergens_2018.pdf. Дата обращения: 03.12.2021.

⁵ RIDA® AllergyScreen. Панели 1, 2, 3, 4 (Регистрационное удостоверение ФС № 2005/348 от 03.03.2005). Режим доступа: http://www.allergen.ru/docs/rida_allergyscreen_panel_1_2_3_4_rus.pdf. Дата обращения: 03.12.2021.

⁶ ООО «Силекс». Биотинилирование антител, белков и выделение клеток с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином. Режим доступа: https://sileks.com/assets/files/protocol-for-kits/biotinilation-and-mag-separation-ver-170626.pdf. Дата обращения: 03.12.2021.

About the authors

Valentina M. Berzhets

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: laball@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5055-7593
SPIN-code: 9097-0947
Scopus Author ID: 6701685093

Doctor of Biology, Professor, Head of the allergen Laboratory 

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

Stanislava Yu. Petrova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: petrovastanislava@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3034-0148
SPIN-code: 7268-6944
Scopus Author ID: 57202912387

MD, candidate of medical Sciences, senior researcher of the laboratory of allergens

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

Lyubov N. Nesterenko

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: lnnesterenko3001@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3825-3906
SPIN-code: 6819-7980
Scopus Author ID: 57197888317

Cand. Sci. (Chem), PhD in Chemistry, Leading Researcher at the Laboratory of viral genome cloning

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

Pavel V. Samoilikov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: samoilikov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3580-3199
SPIN-code: 4294-2188

MD, Cand. Sci. (Med.), senior researcher at the Laboratory of Allergodiagnostics

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

Svetlana V. Khlgatian

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: svetkh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8354-7682
SPIN-code: 1476-4605
Scopus Author ID: 6602216516

Doctor of Biology, Leading Researcher at the  Laboratory of Allergens

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

Nina S. Petrova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: laball21@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2824-1335
SPIN-code: 3151-1562

Cand. Sci. (Biol), leading Researcher at the allergen Laboratory оf allergen

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

Anna V. Vasilyeva

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: annaksu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7703-2698

научный сотрудник лаборатории по разработке аллергенов

Россия, 5а, Malу Каzennyi perеulok, Moscow, 105064

References

Supplementary files