Quantitative and species changes in the local microbiota of the upper respiratory tract in allergic rhinitis

Full Text

Список сокращений

АБА ― атопическая бронхиальная астма

АСИТ ― аллергенспецифическая иммунотерапия

КАР ― круглогодичный аллергический ринит

САР ― сезонный аллергический ринит

СЛИТ ― сублингвальная иммунотерапия

ОБОСНОВАНИЕ

Аллергический ринит ― распространённое среди детей и взрослых аллергическое заболевание, часто сочетающееся с аллергическим конъюнктивитом, атопическим дерматитом и бронхиальной астмой [1]. В последнее время активно исследуется влияние колонизации слизистой оболочки носа различными представителями микрофлоры на частоту и выраженность симптомов, течение и прогноз аллергического ринита [2].

Установлено, что формирование локального дисбиоза слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больных аллергическим ринитом способствует снижению экспрессии эпителием защитных антимикробных факторов под действием локально образующихся медиаторов аллергического воспаления (гистамин) и интерлейкинов 4 и 5 (interleukin, IL) [3].

На формирование аллергической патологии респираторного тракта ребёнка оказывают влияние не только наследственная предрасположенность, но и особенности его резидентной микробиоты [4, 5]. Показано, что симбиотическая микробиота снижает риск формирования аллергических реакций и аллергической патологии органов дыхания, а изменения в составе бактерий симбионтов верхних дыхательных путей могут усиливать локальную пролиферацию базофилов, увеличивать количество эозинофилов и вызывать дисбаланс T1-/T2-иммунного ответа, а также снижать количество регуляторных CD4+Тreg- и CD4+Th17-лимфоцитов [6]. У здоровых лиц отмечено преобладание в составе микробиоты верхних дыхательных путей представителей Propionibacterium spp., Prevotella spp., Corynebacterium spp., Bacteroidetes и Streptococcus spp. по сравнению с больными аллергическими ринитами [7]. Исследования микробиома у пациентов с аллергическим ринитом подтвердили дисбаланс микробиоты, который коррелировал с уровнем общего иммуноглобулина Е (immunoglobulin E, IgE) [8].

Цель исследования ― изучить изменения локальной микробиоты слизистой оболочки носа у больных сезонным (САР) и круглогодичным (КАР) аллергическим ринитом до и после проведённой фармакологической и аллергенспецифической терапии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено обсервационное ретроспективное одноцентровое исследование «случай-контроль».

На первом этапе исследования проводили отбор и обследование пациентов (сбор аллергологического анамнеза, оценка жалоб и симптомов заболевания, сбор биоматериала со слизистой верхних дыхательных путей (носа) на микробиологическое исследование, риноцитологическое исследование, прик-тестирование, определение общего IgE и sIgE-антител к бытовым, пыльцевым и эпидермальным аллергенам, консультация смежных специалистов (пульмонолог, отоларинголог). На втором визите (через 7–10 дней после первого визита) осуществлялось подтверждение клинико-лабораторных критериев включения и/или невключения в исследование, подписание информированного согласия на исследование.

На втором этапе исследования проводили стратификацию пациентов на группы по нозологическим формам (КАР или САР) и характеру проводимой терапии ― базисная терапия или сублингвальная иммунотерапия (СЛИТ). Всем рандомизированным пациентам в зависимости от выявления бактерионосительства (Staphylococcus aureus) на слизистой верхних дыхательных путей исследовали сыворотку крови на специфические IgE (sIgE) к рекомбинантной SplA протеиназе (rSplA) и аллергокомпонентам S. aureus m 80 и m 81, индекс активации CD203c базофилов периферической крови при стимуляции rSplA протеиназой S. aureus; выполняли микробиологическое исследование слизистой оболочки верхних дыхательных путей (до назначения терапии), общий анализ крови, риноцитологическое исследование слизистой верхних дыхательных путей (назальное).

На третьем этапе исследования проводили определение клинико-лабораторных показателей после завершения базисной терапии или СЛИТ (микробиологическое исследование слизистой верхних дыхательных путей, определение sIgE-антител к rSplA протеиназе, индекс активации CD203c базофилов периферической крови при стимуляции rSplA протеиназой S. aureus, риноцитологическое исследование слизистой носа).

Критерии соответствия

Критерии включения. Все пациенты, включённые в исследование, отвечали критериям «включения», которые соответствовали критериям установления диагноза (состояния), приведённым в новых редакциях клинических рекомендаций «Аллергический ринит»¹ и «Бронхиальная астма»².

Критерии невключения: пациенты с неаллергическими ринитами, неатопической бронхиальной астмой; противопоказания к назначению аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ).

Критерии исключения: выраженные аллергические реакции в процессе АСИТ (СЛИТ); самостоятельно принятое решение пациента о прекращении АСИТ (СЛИТ).

Условия проведения

Пациенты наблюдались амбулаторно в специализированной консультативно-диагностической поликлинике инфекционно-аллергических заболеваний ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора Казани (Россия).

Продолжительность исследования

Исследование проводилось на протяжении 6 лет ― в период с 2015 по 2021 год включительно.

Описание медицинского вмешательства

АСИТ (СЛИТ) проводилась в три предсезонно-сезонных курса с сублингвальным введением стандартизированных препаратов Сталораль «Аллерген пыльцы берёзы» (раствор), Оралейр «Аллерген пыльцы луговых трав» (таблетки) и круглогодичным трёхлетним курсом СЛИТ стандартизированным препаратом Сталораль «Аллерген клещей домашней пыли» (раствор) в соответствии с инструкцией к применению. Лечение пыльцевыми аллергенами начинали за 4 месяца до предполагаемого сезона цветения, продолжали в течение сезона пыления до окончания цветения растений.

Подбор препарата СЛИТ проводили на основании данных аллергологического анамнеза, кожных проб и исследования уровня sIgE-антител. Терапию «Аллерген пыльцы берёзы» получили 22 человека, «Аллерген клещей домашней пыли» ― 34, «Аллерген пыльцы луговых трав» ― 12. Базисная терапия аллергического ринита включала назначение топических интраназальных глюко- кортикоидов и антигистаминных препаратов. Базисная терапия астмы включала назначение ингаляционных глюкокортикоидов и длительнодействующих β₂-агонистов.

Основной исход исследования

Для достижения поставленной цели определяли в сравнительном аспекте показатели состава локальной микробиоты верхних дыхательных путей у пациентов с респираторной аллергией в зависимости от терапии ― только базисная терапия и/или терапия с включением СЛИТ (АСИТ). Определяли сенсибилизацию к бактериальной SplA протеиназе S. aureus у пациентов с респираторной аллергией на фоне выявленного бактерионосительства S. aureus и показатели спонтанной и индуцированной бактериальной протеиназой (rSplA) S. aureus активации базофилов и уровень IgE-антител к rSplA до терапии (базисной или СЛИТ) и после её назначения.

Дополнительные исходы исследования

Терапевтический эффект СЛИТ оценивали по уменьшению назальных симптомов, снижению объёма фармакотерапии.

Для оценки терапевтической эффективности санации пациентов с аллергическим ринитом бактерионосителей S. aureus оценивали показатели риноцитограммы (число эозинофилов, микрофлора, число гранулоцитов и лимфоцитов) и результаты бактериологического исследования верхних дыхательных путей.

Анализ в подгруппах

В исследование были отобраны 185 человек в возрасте от 6 до 58 лет, из них 182 человека подписали информированное согласие и продолжили участие в исследовании.

На втором этапе исследования больные были стратифицированы на группы.

В группу 1 вошли больные сезонным аллергическим ринитом и сочетанной формой (САР+АБА), всего 101 человек, которые были разделены на две подгруппы: получающие базисную терапию, всего 67 человек в возрасте от 8 до 58 лет (подгруппа 1А) и получающие в процессе лечения СЛИТ, всего 34 человека (подгруппа 1Б).

Группа 2 включала больных КАР и сочетанной формой респираторной аллергии (КАР+АБА), всего 81 человек в возрасте от 12 до 54 лет, которые также были подразделены на две подгруппы: получающие базисную терапию, всего 47 человек (подгруппа 2А) и получившие в процессе лечения СЛИТ, всего 34 человека (подгруппа 2Б).

Отдельно формировалась контрольная группа ― здоровые лица без аллергической патологии, всего 31 человек в возрасте от 6 до 46 лет (группа «контроль»).

Методы регистрации исходов

Количественные показатели состава микробиоты верхних дыхательных путей характеризовались микробной обсеменённостью слизистой носа такими бактериями, как Staphylococcus spp., Enterobacter spp., Moraxella spp., Haemophilus spp., Klebsiella spp., обсеменённость которыми определяли методом разведений материала, полученного на тампон, который помещали в 1 мл транспортной среды. Готовили серию разведений в 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ раз стерильным физиологическим раствором и высевали по 20 мкл из каждого разведения на соответствующие элективные питательные среды, подсчитывали число КОЕ/мл. Для выделения бактерий применяли селективные среды и соответствующие способы культивирования. Идентификацию бактериальных культур проводили по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам с применением метода матрично-активированной лазерной деcорбционно/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI-TOF MS) [9].

Определение концентраций цитокинов IL-4, IL-5, IL-13, фактора некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor alpha, TNF-α), интерферона гамма (interferon gamma, IFN-γ), IL-17 в культуральной жидкости мононуклеаров периферической крови и сыворотке крови осуществляли иммуноферментным методом с помощью наборов реагентов тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия), eBioscience, Bender Med Systems, Cloud-clone corp. (США).

Показатели спонтанной и индуцированной бактериальной протеиназой rSplA S. aureus активации базофилов определяли методом проточной цитофлоуметрии. Получение и очистку rSplA протеиназы S. aureus осуществляли молекулярно-биологическими методами на основе фрагмента гена splA без сигнального пептида с помощью полимеразной цепной амплификации из геномной ДНК штамма S. aureus NCTC 8325 и клонирования в Escherichia coli согласно стандартным протоколам. В качестве экспрессионной конструкции использовали плазмидный вектор pASG-IBA2 (IBA GmbH, Германия).

Определение IgE-антител к rSplA протеиназе S. aureus проводили путём «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с применением реагентов набора «Спец-IgE-ИФА» (Хема Co., Ltd, Россия). При постановке использовали биотинилированную форму rSplA протеиназы. Использовали калибровочные пробы, содержащие известные количества sIgE (0,35; 0,7; 3,5; 17,5 МЕ/мл).

Определение концентрации IgE в сыворотке крови к аллергенам d 1, d 2 клещей домашней пыли, полыни обыкновенной (w 6) и аллергокомпонентам берёзы (rBet v 1, rBet v 2), эпидермальным аллергенам домашних животных (Can f 1, Can f 2, fel d 1), плесневым грибам, энтеротоксинам А, B (m 80, m 81) S. aureus определяли по технологии ImmunoCAP (Phadia AB) на анализаторе ImmunoCAP 100, v.1 (Phadia AB, Упсала, Швеция).

Прик-тестирование выполнено с использованием коммерческих аллергенов (АО «Биомед» имени И.И. Мечникова, Россия).

Этическая экспертиза

Клиническое исследование одобрено локальным этическим комитетом ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» (выписка из протокола № 3 от 26.05.2015).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Prism версия 8.3.0. В исследовании использованы методы параметрической и непараметрической статистики. Количественные значения представлены относительной частотой встречаемости видов условно-патогенных бактерий микробиоты (частость), медианой и интерквартильным (25-й и 75-й процентили) размахом (Me, Q₁–Q₃). Статистический метод сравнения между группами ― U-критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

У 45 (24,7%) больных группы 1 (САР) были выявлены высокие значения сенсибилизации к аллергокомпоненту берёзы (rBet v 1), у 12 (6,6%) ― к полыни обыкновенной (w 6); сочетанная сенсибилизация к двум аллергокомпонентам берёзы (rBet v 1, rBet v 2) установлена в 18 (9,9%) случаях. В группе 2 (сочетанная респираторная аллергия ― САР+АБА) у 42 (23,1%) человек определена клинически значимая сенсибилизация (>10 kU/l) к аллергену m 1 плесневых грибов Penicillium notatum (рис. 1). У 73 (40,1%) пациентов группы 2 (КАР) во всех возрастных группах выявлены высокие значения сенсибилизации к клещам домашней пыли (d 1, d 2), у 18 (9,9%) ― значимая сенсибилизации к эпидермальным аллергенам домашних животных, из них у 8 (4,41%) к аллергенам Can f 1, Can f 2, у 10 (5,52%) к аллергену Fel d 1 (см. рис. 1).

 

Рис. 1. Концентрация сывороточных антител IgE (M±SD) к пыльцевым, эпидермальным аллергенам и аллергенам клещей домашней пыли у пациентов с сезонным и круглогодичным аллергическим ринитом. Выборка больных САР и САР+АБА ― 101 человек, КАР и КАР+АБА ― 81 человек. САР/КАР ― сезонный/круглогодичный аллергический ринит; АБА ― атопическая бронхиальная астма.

Fig. 1. The level of serum IgE antibodies (M±SD) to pollen, epidermal allergens and house dust mites allergens in patients with allergic rhinitis (seasonal allergic rhinitis and seasonal allergic rhinitis. Sample of patients with seasonal allergic rhinitis and seasonal allergic rhinitis + atopic asthma ― 101 people; year-round allergic rhinitis and year-round allergic rhinitis + atopic asthma ― 81 people. САР/КАР ― seasonal/year-round allergic rhinitis.

 

Уровень сывороточных IgE антител к рекомбинантной термоинактивированной SplA протеиназе S. aureus был определён у 104 пациентов-бактерионосителей S. aureus: в группе 1 (диагнозы САР и САР+АБА) ― у 75 (41,2%), в группе 2 (диагнозы КАР и КАР+АБА) ― у 39 (21,4%) человек (длительное носительство S. aureus, сохраняющееся на протяжении 8 месяцев наблюдения); рис. 2. У детей с САР в возрасте от 6 до 7 лет титр IgE к rSplA протеиназе составил 2,9±0,32 МЕ/мл, а у детей/подростков в возрасте от 8 до 18 лет и взрослых ― 12,4±0,4 МЕ/мл, что свидетельствует о сенсибилизации к стафилококковой протеиназе (см. рис. 2).

 

Рис. 2. Уровни сывороточных IgE-антител (M±SD) к SplA протеиназе Staphylococcus aureus и известным аллергенам золотистого стафилококка ― m 80, m 81 (энтеротоксины SEA и SEB ― Staphylococcal enterotoxin A и Staphylococcal enterotoxin B). Выборка больных САР ― 50 человек, КАР ― 29 человек. САР/КАР ― сезонный/круглогодичный аллергический ринит.

Fig. 2. The level of serum IgE (M±SD) to the bacterial recombinant heat-inactivated SplA proteinase Staphylococcus aureus and known allergens of Staphylococcus aureus ― m 80, m 81 (enterotoxins SEA and SEB ― Staphylococcal enterotoxin A and Staphylococcal enterotoxin B). Sample of patients with seasonal allergic rhinitis ― 50 people, year-round allergic rhinitis ― 29 people. САР/КАР ― seasonal/year-round allergic rhinitis.

 

У больных КАР также выявлено нарастание титров sIgE к рекомбинантной форме SplA протеиназы S. aureus c возрастом (рис. 3). У детей в возрасте от 6 до 7 лет титр был ниже, чем у детей старше 7 лет и взрослых, и составил в среднем 5,2±0,32 МЕ/мл. У взрослых лиц с этой формой ринита титр IgE составлял 18,7±0,42 МЕ/мл, что свидетельствует о выраженной сенсибилизации к этому бактериальному белку.

 

Рис. 3. Цитокиновый профиль при стимуляции мононуклеаров периферической крови rSplA протеиназой и белком А (protein A) Staphylococcus aureus. Верхний ряд: профиль цитокинов (M±SD) Th1/Th17-типа (IFN-γ, TNF-α, IL-17) при стимуляции мононуклеаров rSplA протеиназой и белком А (protein A) Staphylococcus aureus на 3-и сутки культивирования клеток. Нижний ряд: профиль цитокинов (M±SD) Th2-типа (IL-4, IL-5, IL-13) при стимуляции мононуклеаров rSplA протеазой и белком А Staphylococcus aureus на 3-и сутки культивирования клеток. САР ― мононуклеары пациентов с сезонным аллергическим ринитом (10 человек); КАР ― мононуклеары пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом (10 человек); Контроль ― мононуклеары здоровых лиц (контрольная группа, 10 человек). ИЛ ― интерлейкин; ИФН ― интерферон; ТНФ ― фактор некроза опухоли.

Fig. 3. Cytokine profile upon stimulation of peripheral blood mononuclear cells with recombinant SplA proteinase and protein A (protein A) of Staphylococcus aureus. Top row: profile of Th1/Th17-type cytokines (M±SD) (IFN-γ, TNF-α, IL-17) upon stimulation of mononuclear cells with recombinant SplA proteinase and protein A (protein A) of Staphylococcus aureus on the 3rd day cell culture. Bottom row: shows the profile of Th2-type cytokines (M±SD) (IL-4, IL-5, IL-13) upon stimulation of mononuclear cells with rSplA protease and protein A of Staphylococcus aureus on the 3rd day of cell culture. Seasonal allergic rhinitis ― mononuclear cells of patients with seasonal allergic rhinitis (10 people); year-round allergic rhinitis ― mononuclear cells of patients with year-round allergic rhinitis (10 people); Control ― mononuclear cells of healthy individuals (control group, 10 people). ИЛ ― interleukin (IL); ИФН ― interferon (IFN); ТНФ ― tumor necrosis factor (TNF).

 

Основные результаты исследования

Изменение состава микробиоты слизистой оболочки верхних дыхательных путей при аллергическом рините оценивали до и после проведённой терапии при достижении ремиссии и контроля симптомов заболевания.

Встречаемость S. aureus в стадии обострения САР (группа 1) была достоверно выше, чем в стадии ремиссии после проведения базисной терапии (табл. 1). Встречаемость S. aureus после фармакологической терапии в стадии ремиссии заболевания снизилась в 1,4 раза, а при включении в терапию АСИТ (СЛИТ) ― в 3,9 раза по сравнению только с базисной терапией. В стадии ремиссии САР частота выделения S. aureus у больных после СЛИТ фактически была такой же, как в группе контроля (см. табл. 1). У пациентов с САР выявлено также статистически значимое снижение в составе локальной микробиоты верхних дыхательных путей представителей других комменсальных видов коагулазонегативных стафилококков, таких как Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hominis и увеличение Staphylococcus haemolyticus.

 

Таблица 1. Частота выделения (Me, Q₁; Q₃) условно-патогенных представителей локальной микробиоты верхних дыхательных путей у пациентов с респираторной аллергией в сформированных группах до и после соответствующей терапии, ٪

Table 1. Frequency of isolation (Me, Q₁; Q₃) of opportunistic representatives of the local microbiota of the upper respiratory tract in patients with respiratory allergies in formed groups before and after appropriate therapy, ٪

Сезонный аллергический ринит и сочетанные формы (САР+АБА)
Вид	Группы				p
	1 (n=101)	2 (n=67)	3 (n=34)	4 (n=31)
Staphylococcus aureus	41,8 (23,7; 76,5)	28,5 (13,0; 42,8)	10,5 (5,1; 12,8)	6,5 (3,6; 9,5)	p1–4 <0,05 p2–4 <0,05 p1–3 <0,05 p3–4 <0,05
Staphylococcus haemolyticus	37,2 (14,6; 47,8)	25,0 (10,7; 34,8)	17,0 (16,2; 45,8)	7,0 (3,7; 12,4)	p1–3 <0,05 p2–3 <0,05 p3–4 <0,05
Staphylococcus saprophyticus	н/о	н/о	н/о	25,3 (9,4; 34,8)	-
Staphylococcus epidermidis	9,0 (2,7; 14,8)	5,0 (2,9; 7,6)	26,7 (14,5; 38,9)	63,6 (7,1; 78,5)	p1–3 <0,05 p2–3 <0,05 p3–4 <0,05
Enterobacter spp.	15,6 (6,5; 25,6)	н/о	н/о	5,3 (3,6; 7,5)	p1–4 <0,05
Haemophilus influenzae	5,0 (1,7; 6,9)	н/о	н/о	5,4 (2,7; 7,5)	p1–4 >0,05
Haemophilus parainfluenzae	16,0 (4,9; 25,5)	18,0 (8,3; 26,8)	н/о	17,5 (6,2; 31,8)	p1–2 >0,05 p2–4 >0,05 p1–4 >0,05
Haemophilus haemolyticus	22,0 (3,3; 28,5)	16,0 (3,1; 25,7)	7,0 (2,4; 10,8)	н/о	p1–3 <0,05 p2–3 <0,05
Круглогодичный аллергический ринит и сочетанные формы (КАР+АБА)
Вид	Группа				p
	1 (n=81)	2 (n=47)	3 (n=34)	4 (n=31)
Staphylococcus aureus	53,6 (14,9; 68,5)	18,7 (12; 25,0)	5,6 (2,5; 6,0)	н/о	p1–3 <0,05 p1–2 <0,05 p2–3 <0,05
Staphylococcus epidermidis	25,6 (4,5; 30,0)	38,5 (11,5; 30,5)	46,3 (10,5; 53,0)	67,8 (25,7; 74,0)	p1–3 <0,05 p2–3 >0,05 p1–4 <0,05
Staphylococcus haemolyticus	н/о	н/о	14,5 (7,0; 20)	16,0 (5,5; 19,5)	p3–4 >0,05
Staphylococcus saprophyticus	н/о	н/о	28,9 (9,0; 31,0)	32,2 (8,5; 42,0)	p3–4 >0,05
Staphylococcus hylosus	8,3 (3,5; 12,1)	9,0 (4,0; 12,5)	н/о	н/о	p1–2 >0,05
Moraxella spp.	26,6 (10,5; 36,8)	16,7 (4,8; 28,6)	8,3 (4,5; 12,5)	7,9 (4,3; 11,2)	p1–4 <0,05 p1–2 <0,05 p3–4 <0,052 p2–3 <0,05
Enterobacter spp.	42,5 (23,9; 50,5)	16,2 (7,1; 23,5)	н/о	н/о	p1–2 <0,05
Haemophilus influenzae	25,0 (12,5; 43,8)	15,0 (7,6; 21,5)	н/о	н/о1 5,3 (1,5; 7,0)2	p1–4 <0,05 p2–4 <0,05
Haemophilus parainfluenzae	24,0 (10,3; 32,8)	18,0 (8,5; 27,8)	5,0 (2,5; 9,5)	12,5 (5,3; 34,6)1	p1–3 <0,05 p1–4 <0,05 p2–3 <0,05 p3–4 <0,05
Haemophilus haemolyticus	18,0 (4,6; 29,0)	17,0 (3,4; 28,7)	6,0 (3,8; 8,5)	8,0 (4,4; 9,5)	p1–3 <0,05 p1–4 <0,05 p2–3 <0,05 p3–4 >0,05

Примечание. Частота встречаемости микроорганизмов рассчитана на основе анализа данных в период осенне-зимнего¹ и весенне-летнего² сезонов. Статистическую значимость между группами (p_1–4) оценивали по U-критерию Манна–Уитни (p <0,05). Группы 1 ― стадия обострения; 2 ― стадия ремиссии (базисная терапия); 3 ― стадия ремиссии (СЛИТ); 4 ― Контроль. САР/КАР ― сезонный/круглогодичный аллергический ринит; АБА ― атопическая бронхиальная астма; СЛИТ ― сублингвальная иммунотерапия; н/о ― не определялся.

Note. The frequencies of occurrence of microorganisms are calculated based on data analysis during the autumn-winter¹ and spring-summer² seasons. Statistical significance between groups (p_1–4) was assessed using the Mann–Whitney U-test (p <0.05). Groups 1 ― exacerbation stage; 2 ― remission stage (baseline therapy); 3 ― remission stage (СЛИТ); 4 ― Control. САР/КАР ― seasonal/year-round allergic rhinitis; АБА ― atopic bronchial asthma; СЛИТ ― sublingual immunotherapy; н/о ― not determined.

 

Выявлена высокая частота встречаемости S. aureus, превышающая таковую в 5,1 раза в группе контроля, в составе локальной микробиоты верхних дыхательных путей у пациентов с диагнозом САР+АБА в острую стадию заболевания. В острую стадию заболевания отмечено снижение частоты колонизации верхних дыхательных путей S. epidermidis и отсутствие колонизации локальных биотопов S. hominis и S. saprophyticus.

У большинства (85,0%) пациентов с диагнозом САР+АБА в период обострения заболевания определялась высокая степень бактериальной обсеменённости верхних дыхательных путей S. aureus ― 10⁴–10⁵ КОЕ/мл (2,0–5,0 Log10 КОЕ/мл), в период ремиссии степень обсеменённости снизилась до 10²–10³ КОЕ/мл (2,0–3,0 Log10 КОЕ/мл) у 45,0% больных.

После проведённой СЛИТ выявлено снижение частоты колонизации слизистой верхних дыхательных путей S. aureus, Staphylococcus haemolyticus и увеличение частоты колонизации S. epidermidis (см. табл. 1).

В группе пациентов с КАР отмечена такая же закономерность: частота выделения S. aureus со слизистой верхних дыхательных путей по сравнению с группой контроля была в 9,5 раз выше при обострении заболевания и снижалась в стадию ремиссии, когда максимальная встречаемость этого вида отмечалась только в весенне-летний период (см. табл. 1).

В группе пациентов с КАР в стадию обострения заболевания фактически у половины больных локальный биотоп верхних дыхательных путей колонизируется S. aureus (см. табл. 1). Отмечено также снижение колонизации S. epidermidis. Нами отмечен положительный эффект СЛИТ по сравнению с базисной фармакотерапией, проявившийся снижением частоты колонизации слизистой верхних дыхательных путей S. aureus и увеличением колонизации комменсальными негемолитическими стафилококками (S. epidermidis); см. табл. 1.

Полученные нами данные показали, что у 74,4% больных КАР в период обострения заболевания отмечена высокая степень бактериальной обсеменённости S. aureus (от 10⁴–10⁵ КОЕ/мл), и только у 25,6% она не превышала 10³ КОЕ/мл. В ремиссию заболевания у 64,0% больных с различными формами аллергического ринита (КАР и САР) сохранялось бактерионосительство S. aureus, и степень бактериального обсеменения составляла 10³–10⁴ КОЕ/мл, у 36,0% больных аллергическими ринитами происходило снижение обсеменённости до 10² КОЕ/мл.

У больных аллергическим ринитом локальная микробиота слизистой оболочки верхних дыхательных путей характеризовалась полимикробным спектром. В острую стадию заболевания у детей/подростков и взрослых лиц отмечено увеличение частоты колонизации слизистой верхних дыхательных путей грамотрицательными бактериями, относящимися к Enterobacter spp., Moraxella spp., а также гемофильными бактериями Haemophilus parainfluenzae и Haemophilus haemolyticus (см. табл. 1). После СЛИТ в стадию ремиссии заболевания (4-й визит) частота колонизации грамотрицательными бактериями снижалась, а представители Enterobacter spp. и гемофильных бактерий (Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae) не выделялись.

Изучение активации базофилов крови термоинактивированной rSplA протеиназой S. aureus по интенсивности экспрессии CD203c. В тесте с клетками периферической крови нами был выявлен дозозависимый эффект рекомбинантной термоинактивированой SplA протеиназы S. aureus на экспрессию CD203c на базофилах крови у больных аллергическим ринитом и сочетанной формой респираторной аллергии. Экспрессия CD203c увеличивается на базофилах в ответ на перекрёстное связывание аллергенов с рецептором для IgE-антител [10].

Нами установлена значимая активация экспрессии CD203c у пациентов с респираторной аллергией, включённых в исследование, по сравнению с группой контроля (p <0,05) (табл. 2). При сопоставлении подгрупп по терапии установлено снижение индекса активации базофилов периферической крови rSplA протеиназой S. aureus в 1,2–1,5 раза у пациентов с САР, а также с сочетанной формой (САР+АБА) и КАР без астмы, получивших полный курс СЛИТ, по сравнению с участниками исследования, получившими только базисную фармакотерапию (см. табл. 2).

 

Таблица 2. Значение индекса активации CD203c базофилов периферической крови при стимуляции термоинактивированной rSplA протеиназы Staphylococcus aureus у больных респираторной аллергией в зависимости от проведённой терапии

Table 2. The value of the CD203c activation index of peripheral blood basophils upon stimulation of heat-inactivated rSplA proteinase Staphylococcus aureus in patients with respiratory allergies, depending on the therapy performed

Группы	Индекс активации базофилов к rSplA протеиназе, Me (Q1–Q3)		Уровень IgE к rSplA протеиназе, МЕ/мл (ELISA)
	СЛИТ, ремиссия	Базисная терапия, ремиссия
Сопоставление по терапии
CАР, n=50	2,1 (2,0–2,3)*	3,1 (3,0–3,4)	<5,6
CАР+АБА, n=40	2,3 (2,0–2,4)*	3,4 (3,2–3,6)	5,7 до 7,0
САР+АБА, n=11	3,4 (3,0–3,6)	3,2 (3,0–3,6)	>7,1
КАР, n=29	2,6 (2,3–2,8)*	3,1 (3,0–3,4)	5,7 до 7,0
КАР+АБА, n=52	3,1 (2,8–3,5)	3,2 (3,0–3,4)	>7,0
Сопоставление с контрольной группой
Нозологическая характеристика групп	Группы 1 и 2	Контроль
САР, n=50	3,2 (3,0–3,5)*	1,1 (1,0–1,5)
САР+АБА, n=51	3,4 (3,2–3,6)*
КАР, n=29	3,2 (3,0–3,4)*
КАР+АБА, n=52	3,1(3,0–3,4)*

Примечание. * Статистическую значимость между подгруппами с сенсибилизацией к rSplA протеиназе Staphylococcus aureus определяли по U-критерию Манна–Уитни. Базофилы периферической крови инкубировали при 37°С в течение 15 минут с rSplA протеиназой (1,0 мкг/мл) и античеловеческим IgE (1,0 мкг/мл) в питательной среде и анализировали экспрессию CD203c методом проточной цитофлоуметрии. Индекс активации рассчитывали как отношение MFI_стим./MFI_{контроль.} САР/КАР ― сезонный/круглогодичный аллергический ринит; АБА ― атопическая бронхиальная астма; СЛИТ ― сублингвальная иммунотерапия.

Note. * Statistical significance between subgroups with sensitization to Staphylococcus aureus rSplA proteinase was determined using the Mann–Whitney U-test. Basophil blood cells were incubated at 37°С for 15 minutes with rSplA proteinase (1.0 μg/ml) and anti-human-IgE (1.0 μg/ml) in a nutrient medium and CD203c expression was analyzed by flow cytometry. The activation index was calculated as the ratio of MFI_stim./MFI_control. САР/КАР ― seasonal/ year-round allergic rhinitis; АБА ― atopic bronchial asthma; СЛИТ ― sublingual immunotherapy; н/о ― not determined.

 

Дополнительные результаты исследования

Нами дополнительно проведено исследование цитокинового профиля культур мононуклеаров периферической крови. При стимуляции культуры мононуклеаров периферической крови больных аллергическим ринитом rSplA протеиназой установлена продукция преимущественно Th2-цитокинов (IL-13, IL-5, IL-4) в отличие от стимуляции этих клеток белком А S. aureus. Полученные нами данные подтверждают, что Spl протеиназы S. aureus способны вызывать у больных аллергическим ринитом и сочетанными формами респираторной аллергической патологии (АР+АБА) формирование T2-иммунного ответа и образование специфичных IgЕ антител к SplA протеиназе, тогда как естественный адаптивный иммунный ответ к известным антигенам стафилококков, в частности к белку A, в основном характеризуется развитием Т1-иммунного ответа с цитокиновым Th1/Th17-профилем [11, 12]. При сравнительном исследовании культуры мононуклеаров периферической крови здоровых лиц в ответ на стимуляцию белком А S. aureus происходило статистически значимое нарастание продукции Th1/Th17-цитокинов (IFN-γ, TNF-α, IL-17) по сравнению со стимуляцией rSplA протеиназой S. aureus (см. рис. 3). В тесте с культурой мононуклеаров периферической крови здоровых лиц rSplA протеиназа S. aureus, в отличие от белка А S. aureus, менее активно стимулировала продукцию Th1/Th17-цитокинов, при этом продукцию Th2-цитокинов (IL-5, IL-13) она активировала более выраженно (см. рис. 3).

Нежелательные явления

Местные реакции в ходе проведения СЛИТ, которые развивались в начале лечения, проявлялись зудом в полости рта, отёком слизистой оболочки ротовой полости и самостоятельно проходили в течение 15–30 минут после приёма аллергена, отмечены у 5 (2,7%) пациентов, из них в 3 (1,6%) случаях с целью купирования и уменьшения симптомов назначались антигистаминные препараты. Лёгкие системные реакции выражались зудом в носу, ринореей, чиханием, кожным зудом и были отмечены у 3 (1,6%) пациентов. Тяжёлых системных реакций в ходе исследования не зарегистрировано.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В настоящем исследовании нами проведена оценка изменений локальной микробиоты у пациентов с аллергическими заболеваниями верхних дыхательных путей, страдающих как только аллергическим ринитом, так и в сочетании с АБА, в зависимости от проводимой терапии. У больных, получавших АСИТ в форме СЛИТ, в отличие от пациентов, получивших базисную терапию, выявлено увеличение встречаемости комменсальных стафилококков (S. epidermidis) и снижение встречаемости гемолитических форм бактерий и золотистого стафилококка.

Обсуждение основного результата исследования

Показано, что у больных САР в стадии обострения заболевания возрастала частота выделения S. aureus, S. haemolyticus, Enterobacter spp., Moraxella catarrhalis, снижалась частота встречаемости S. epidermidis и других коагулазонегативных стафилококков (Staphylococcus homonis) на фоне снижения встречаемости комменсалов. В стадии ремиссии заболевания после проведении базисной фармакотерапии состав микробиоты носа существенно не изменялся: сохранялось доминирование потенциально патогенных гемолитических стафилококков S. aureus, S. haemolyticus, возрастала частота выделения других гемолитических форм бактерий (Moraxella catarrhalis, Haemophilus haemolyticus) на фоне снижения комменсалов S. epidermidis и S. homonis.

В сыворотке крови пациентов с респираторной аллергией (КАР и САР) были выявлены IgE, специфически связывающиеся с белком секретома S. aureus, идентифицированным как Spl протеиназа S. aureus. У больных аллергическим ринитом и сочетанной респираторной аллергией (АР+АБА) воздействие на базофилы периферической крови rSplA протеиназой S. aureus приводило к значимой активации экспрессии CD203c по сравнению с контрольной группой. У больных респираторной аллергией (САР, КАР, САР+АБА) с титром IgE-антител к rSplA протеиназе более 7,0 МЕ/мл индекс активации базофилов периферической крови был в 3,0 раза выше, чем у несенсибилизированных здоровых бактерионосителей контрольной группы.

Нами также установлено, что титр IgE-антител к rSplA протеиназе S. aureus при САР и КАР увеличивался с возрастом, т.е. речь идёт о формировании сенсибилизации к бактериальному компоненту стафилококков на фоне дисбиоза микрофлоры локальной микробиоты слизистой верхних дыхательных путей и носоглотки. Выявленная сенсибилизация к продуктам условно-патогенной микробиоты у пациентов с респираторной аллергией подтверждена нами в тесте с культурой мононуклеаров периферической крови здоровых лиц контрольной группы, где rSplA протеиназа S. aureus, в отличие от белка А S. aureus, менее активно стимулировала продукцию Th1/Th17 цитокинов, при этом более активно индуцировала продукцию цитокинов T2-иммунного ответа (IL-5, IL-13).

Ограничения исследования

Ограничения могут быть обусловлены одноцентровым форматом исследования и размером выборки.

Поскольку при планировании и проведении исследования размер выборки для достижения требуемой статистической мощности результатов предварительно не рассчитывался, полученная в ходе исследования выборка участников не может считаться в достаточной степени репрезентативной, что не позволяет экстраполировать полученные результаты и их интерпретацию на генеральную совокупность аналогичных пациентов за пределами исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У пациентов с аллергическим ринитом выявлены количественные и качественные изменения микробиома слизистой оболочки верхних дыхательных путей, проявляющиеся в том числе повышением колонизации S. aureus, одним из последствий которого является развитие IgE-опосредованной сенсибилизации к продуктам жизнедеятельности золотистого стафилококка, в частности к Spl протеазам. Аллергенспецифическая иммунотерапия у пациентов с аллергическим ринитом приводит к снижению колонизации слизистой носа S. aureus, а также снижению сенсибилизации к rSplA протеиназе.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования и подготовке публикации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведённым исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Ю.А. Тюрин — проведение иммунологических исследований, обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; А.А. Шарифуллина — формирование групп, аллергологическое обследование и лечение пациента, подготовка и написание текста статьи; И.Д. Решетникова — аллергологическое обследование и лечение пациента, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; Р.А. Миннибаев — сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; Р.З. Хайруллин — проведение микробиологических исследований, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; Р.С. Фассахов — концепция исследования, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи.

Благодарности. Авторы выражают благодарность ст. науч. сотр., канд. биол. наук Григорьевой Татьяне Владимировне (Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия) за помощь в проведении масс-спектрометрических методов исследования образцов методом MALDI-TOF MS.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Yu.A. Tyurin, R.S. Fassakhov ― designed the study; Yu.A. Tyurin, R.Z. Khairullin, A.A. Sharifullina, I.D. Reshetnikova ― performed experiments; Yu.A. Tyurin, R.Z. Khairullin, R.A. Minnibaev, A.A. Sharifullina, I.D. Reshetnikova ― analyzed data; Yu.A. Tyurin, R.S. Fassakhov ― wrote the manuscript with input from all authors; R.S. Fassakhov ― oversaw the project.

Acknowledgments. The authors express their gratitude to senior researcher, candidate of biological sciences, Tatyana V. Grigorieva (Volga Federal University, Kazan, Russia) for her assistance in carrying out mass spectrometric methods for studying samples using the MALDI-TOF MS method.

 

¹ Клинические рекомендации «Аллергический ринит». Российская ассоциация аллергологов и клинических иммунологов, Национальная медицинская ассоциация оториноларингологов, Союз педиатров России; 2022.

² Клинические рекомендации «Бронхиальная астма». Российское респираторное общество, Российская ассоциация аллергологов и клинических иммунологов, Союз педиатров России; 2023.

About the authors

Yury A. Tyurin

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan State Medical University

Email: tyurin.yurii@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2536-3604
SPIN-code: 5089-5565

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Kazan; Kazan

Alsu A. Sharifullina

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan Federal University

Email: alsusha74@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2395-7377

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Kazan; Kazan

Irina D. Reshetnikova

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan Federal University

Email: reshira@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3584-6861
SPIN-code: 3255-0088

MD, Cand. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Kazan; Kazan

Rustam A. Minnibayev

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: rustam.md@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-3421-6221
Russian Federation, Kazan

Ruslan Z. Khairullin

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: co1979@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4214-012X
SPIN-code: 7032-9137

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Kazan

Rustem S. Fassakhov

Kazan Federal University

Author for correspondence.
Email: farrus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9322-2689
SPIN-code: 1748-7760

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files