CELL PENETRATING PEPTIDE COMPLEXED WITH SIRNA TARGETED TO IL-4 DECREASE AIRWAY INFLAMMATION AND AIRWAY HYPER RESPONSIVENESS IN A MOUSE MODEL OF ALLERGIC ASTHMA

Abstract

Full Text

Бронхиальная астма (БА) является одним из самых распространенных хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей, от которого страдают как взрослые, так и дети. Данное заболевание распространено среди разных слоев населения, имеет высокий уровень смертности, а при отсутствии квалифицированной помощи приводит к ухудшению качества жизни населения и экономическим потерям для государства [1]. В виду продолжающегося роста заболеваемости БА остается актуальной задача поиска значимых биологических мишеней с целью разработки новых способов терапии. Недавние успехи в области молекулярной иммунологии, генетики и биоинформатики позволили выявить гены, вовлеченные в патогенез БА. Исследования на нокаутных животных, а также с применением моноклональных антител, установили ключевую роль ИЛ-4 в патогенезе данного заболевания. В частности, ИЛ-4 способствуют синтезу В-клетками специфических IgE-антител, миграции эозинофилов в участок воспаления и гиперреактивности бронхов [2-5]. Данные исследования создали предпосылки для появления лекарственных препаратов нового типа, способных регулировать активность патогенетически-зна-чимых генов. К настоящему моменту известен ряд технологий для сиквенс-специфической регуляции генов (АСО, Рибозимы, ДНКзимы, EGS, ДНК-ловуш-ки, Ш-адапторы), однако использование феномена интерференции РНК является наиболее перспективным с точки зрения эффективности и экономической целесообразности [6]. Под интерференцией РНК понимают естественный механизм регуляции экспрессии генов в клетке с участием фермента Dicer и молекул малых интерферирующих РНК (миРНК). Однако одна из главных проблем на пути внедрения миРНК-со-держащих препаратов в медицинскую практику является низкая эффективность их проникновения в клети-мишени. Поэтому для доставки 204 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал Комплекс катионного пептида и молекул миРНК против ИЛ-4 эффективно снижают гиперреактивность бронхов и аллергическое воспаление на мышиной модели бронхиальной астмы молекул миРНК разрабатываются различные носители (полимеры, липосомы и наночастицы), однако наиболее перспективными с точки зрения безопасности являются катионные пептиды. Они способны электростатически взаимодействовать с миРНК, формируя нано-структурные комплексы, которые за счет эндоцитоза проникают в клетки, при этом ввиду био-совместимости, пептиды не проявляют токсических эффектов на организм человека. В ходе предыдущих экспериментальных работ был создан комплекс, состоящий из катионного дендримерного пептида (LTP) и молекул миРНК, подавляющих ИЛ-4 (siIL4) [7-9]. Поэтому целью данного исследования было изучить эффекты созданного комплекса siIL-4/LTP на мышиной модели аллергической бронхиальной астмы. Материалы и методы. В работе использована ранее созданная мышиная модель аллергической БА [10, 11]. Для этого самки мышей BALB/c были разделены на 3 группы. Группы 1 и 2 иммунизировали внутрибрюшинным введением OVA (20 мкг/мышь), эмульгированного в Al(0H)3 (2 мг/ мышь) в 0, 14 и 28 дни эксперимента. Провокации путем интраназального (и/н) введения 1% OVA (50 мкл/мышь) проводились в 41-43 дни. Группа 1 получала аэрозольно 88 мкг/мышь siIL-4/LTP в дни 37-43. Группа 2 получала аналогичным курсом контрольный препарат миРНК против гена GFP в комплексе с тем же самым пептидом LTP (siGFP/LTP). Группа 3 никаким манипуляциям не подвергалась. Измерялись уровни сывороточных OVA-специфических IgE, IgG1, IgG2a антител методом ELISA в день 44. Гиперреактивность дыхательных путей (ГРБ) измерялась с помощью неинвазивной плетизмографии на 44 день. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) собирали на 45 день и анализировали с помощью световой микроскопии. Левое легкое отбирали для гистологического анализа, правое - для анализа генной экспрессии методом ПЦР. Результаты. Мыши, получавшие 7 ингаляций siIL-4/LTP, демонстрировали снижение экспрессии гена ИЛ-4 в клетках БАЛ на 30% в сравнении с животными, получавшими ингаляционно контрольный неспецифический препарат siGFP/ LTP. Однако несмотря на снижение ИЛ-4 в легких уровни сывороточных OVA-специфических антител классов IgE, IgG2a и IgG1 были сходными у первых двух групп. По всей видимости комплекс siIL-4/LTP действует локально, не всасываясь в системный кровоток. У мышей, получавших ин-галяционно siIL-4/LTP, происходило снижение гиперреактивности бронхов в среднем на 20% в сравнении с животными после ингаляции siGFP/ LTP. Анализ клеточного состава БАЛ показал, что ингаляционное введение siIL-4/LTP приводит к снижению инфильтрации эозинофилов на 38%, что указывает на нивелирование аллергического воспаления в легких. Гистологический анализ ткани легких подтвердил снижение уровня аллергического воспаления, а также выявил снижение уровня ремоделирования бронхов, что заключалось в подавлении гиперплазии бокаловидных клеток. Заключение. Аэрозольное введение комплекса siIL-4/LTP, подавляющего экспрессию про-вос-палительного цитокина - ИЛ-4, нивелирует признаки экспериментальной бронхиальной астмы, в частности, снижает уровень гиперреактивности бронхов и степень аллергического воспаления в легких. Все это свидетельствует о том, что применение молекул миРНК для регуляции экспрессии про-воспалительных генов является перспективным направлением в создании генно-терапевтических лекарственных средств нового поколения