TLR-MEDIATED CYTOKINE PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS IN ASTHMATIC PATIENTS

Abstract

Full Text

Toll-подобные рецепторы (TLRs) являются рецепторами врожденного иммунитета и играют ключевую роль в защите организма от патогенов, распознавая консервативные структуры микроорганизмов, так называемые PAMP (пато-ген-ассоциированные молекулярные паттерны). При распознавании лигандов TLRs происходит запуск каскада сигнальных молекул, в результате которого экспрессируются гены про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов, кости-муляторных молекул. На протяжении последних лет активно изучается роль TLRs в патогенезе различных заболеваний, в том числе бронхиальной астмы (БА) [1]. Одним из механизмов развития бронхиальной астмы является дисбаланс T-хелперов 1-го типа (Th1) и T-хелперов 2-го типа (Th2), про- и противовоспалительных цитокинов. Известно, что TLRs могут участвовать в регуляции дифференцировки Th, действие лигандов TLRs в раннем возрасте индуцирует созревание Th1, снижая Th2-зависимый ответ. Показано, что некоторые аллергены могут содержать в своем составе такие широко распространенные лиганды TLRs, как ЛПС или ß-глюканы, кроме того, не которые аллергены (например, аллергены клещей домашней пыли) способны непосредственно индуцировать TLR-зависимый сигнальный путь [2]. Таким образом, действие аллергенов может приводить к усиленной выработке цитокинов, развитию хронического воспаления, и усугублять течение бронхиальной астмы. Целью данного исследования является определение опосредованной лигандами TLRs выработки про- и противос-палительных цитокинов МНК периферической крови больных БА. Материалы и методы. Группу обследуемых составили 36 больных бронхиальной астмой в возрасте 18-45 лет. Пациенты были разделены на группы: I группа - пациенты с атопической бронхиальной астмой (n=23), среди них у 12 больных -легкая степень, у 11 - средняя степень тяжести заболевания; II группа - 13 пациентов со смешанной формой бронхиальной астмы средней степени тяжести. Все обследуемые наблюдались в отделении иммунопатологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Диагноз устанавливался в соответствии с критериями GINA (2016). Критериями включения в исследование 184 Р оссийский .^Аллергический ^Журнал TLR-опосредованная выработка цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови больных бронхиальной астмой. являлся установленный диагноз бронхиальной астмы, отказ от приема системных глюкокорсти-костероидов минимум за 4 недели до забора крови для проведения исследования, отсутствие хронических заболеваний в анамнезе. Контрольную группу составили 20 здоровых доноров в возрасте от 18 до 47 лет. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной периферической крови (25 ед/1 мл крови) здоровых доноров и больных БА в одноступенчатом градиенте плотности фи-колл-урографина (1,077 г/см3). Полученные клетки культивировали в среде PRMI-1640 (HyClone) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma), 100 мкг/мл гентамицина и 2 mML-глутамина (Sigma) в течение 24 часов в СО2-инкубаторе. Рабочая концентрация клеток составила 1*106 в мл. В качестве лигандов TLR использовали ЛПС (E.Coli 0111:B4, Sigma) в дозе 0,1 мкг/мл, ПГ (Staphylococcus aureus, InvivoGen) в дозе 2,5 мкг/мл, действующие через TLR4 и TLR2 соответственно. Контролем служили МНК, культивированные только в среде RPMI 1640. Полученные супернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -70оС. Концентрацию ФНОа, ИЛ-18, ИЛ-10 и ИЛ-33 в супернатантах МНК определяли с помощью иммуноферментного анализа, использовали коммерческие наборы фирмы «e-Biosciences». При обработке результатов пользовались программным обеспечением STATISTICA 6.0. Данные выражали в виде медианы (Ме) и 25-75 перцентилей. Для оценки статистической значимости использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Уровень достоверности считали значимым при p<0,05. Результаты и обсуждение. Для определения TLR-опосредованной выработки цитокинов МНК больных БА и здоровых доноров стимулировали агонистами TLR2 и TLR4, ПГ и ЛПС, соответственно. На первом этапе оценивали TLR2- и TLR4-опосредованную выработку ФНОа у больных БА. ФНОа является одним из наиболее важных провоспалительных цитокинов. Известно, что ФНОа действует на гладкие мышцы дыхательных путей, увеличивая сократительный ответ, и может принимать участие в развитии астмы. В ряде работ было показано, что в плазме больных БА повышено содержание ФНОа [3, 4]. Выявили, что спонтанная продукция ФНОа МНК периферической крови в группе больных атопической БА составила 615,21 (390,71-916,29) пг/мл, в группе больных смешанной БА - 677,5 (408,57859) пг/мл, что статистически достоверно выше, чем у здоровых доноров (103,51 (59-312) пг/мл). Наибольшее увеличение концентрации ФНОа во всех группах наблюдалось при стимуляции ПГ. В результате проведенных исследований установили, что при стимуляции ПГ концентрация ФНОа достоверно выше у больных атопической БА средней степени тяжести - 2628,42 (2116-3068,6) пг/мл, чем у больных с легким течением заболевания - 1846,14 (1182-2053) пг/мл (р<0,05). Во II группе индуцированная ПГ продукция ФНОа также достоверно выше, чем у здоровых доноров (2654,14 (1982-3628,14) пг/мл и 1081,43 (967,141198) пг/мл, соответственно). При использовании ЛПС также наблюдается достоверное увеличение концентрации ФНОа в группах больных атопической БА средней степени тяжести и смешанной БА по сравнению со здоровыми донорами: 2106,1 (1541,43-2845,7) пг/мл, 1989 (1293,6-2294,7) пг/мл и 956 (782,03-1407) пг/мл, соответственно. Повышенная выработка ФНОа под действием лигандов TLR может способствовать развитию стойкого воспалительного процесса у больных БА. На следующем этапе оценивали стимулированную лигандами TLR2 и TLR4 выработку ИЛ-18 МНК больных БА и здоровых доноров. Спонтанная продукция ИЛ-18 МНК больных атопической и смешанной формами БА была достоверно выше, чем в группе здоровых доноров (292 (277-302) пг/мл, 279,5 (264,5-292) пг/мл и 124,5 (112-132) пг/мл, соответственно), при этом не выявили различий между группами больных. Стимуляция ЛПС и ПГ МНК периферической крови здоровых доноров и больных БА не приводила к существенным изменениям выработки ИЛ-18, при этом индуцированная продукция ИЛ-18 у больных БА была достоверно выше, чем в группе здоровых доноров. ЛПС-индуци-рованная продукция ИЛ-18 у здоровых доноров составила 142 (137-152) пг/мл, у больных БА легкой степени тяжести - 304,5 (249,5-334,5) пг/мл, средней степени тяжести - 302 (277-302) пг/мл, у больных смешанной БА - 319,5 (294,5-334,5) пг/ мл. ПГ-индуцированная выработка ИЛ-18 МНК здоровых доноров составила 149,5 (132-172) пг/ Р оссийский .^Аллергический ^Журнал 185 Хорева М.В., Латышева Т.В., Смирнова А.Д., Грачева Л.А., Бологов А.А., Захаров М.В. мл, больных БА легкой степени тяжести - 324,5 (299,5-364,5) пг/мл, средней степени тяжести - 332 (292-352) пг/мл, больных БА смешанного типа - 417 (369,5-432) пг/мл. На экспериментальных мышиных моделях показано, что ИЛ-18 может усиливать выработку цитокинов Th2, индуцируя синтез IgE и таким образом участвовать в развитии аллергического воспаления [5]. В исследованиях последних лет показано, что ИЛ-33 играет важную роль в развитии аллергических заболеваний. ИЛ-33 - мультифункцио-нальный цитокин, он активирует как гемопоэти-ческие клетки (NK-, NKT-клетки, Т-лимфоциты и др.), так и клетки негемопоэтического происхождения. Впервые ИЛ-33 был обнаружен в эпителии бронхов и дыхательных путей, фибробластах и гладкомышечных клетках, что указывало на роль этого цитокина в регуляции защиты слизистых оболочек[6]. У больных бронхиальной астмой была обнаружена высокая экспрессия ИЛ-33 в легочной ткани [7]. Мы не выявили повышения спонтанной продукции ИЛ-33 МНК периферической крови больных БА. Стимуляция лигандами TLR2 и TLR4 также не приводила к достоверному увеличению выработки ИЛ-33 МНК больных БА по сравнению со здоровыми донорами. Возможно, повышение концентрации ИЛ-33 у больных с аллергопатологией обусловлено продукцией этого цитокина клетками эпителия дыхательных путей. Оценивали спонтанную и индуцированную продукцию ИЛ-10 МНК больных БА и здоровых доноров. ИЛ-10 является противовоспалительным цитокином, может регулировать баланс цитокинов Th1/Th2 типа и направлять дифференцировку Th в сторону Th2 типа, усиливая аллергическое воспаление [8]. Выявили, что спонтанная выработка ИЛ-10 МНК достоверно повышена у больных атопической БА средней степени тяжести по сравнению со здоровыми донорами - 129,3 (61,58-201,48) пг/мл и 45,20 (33,1684,5) пг/мл. Под действием ЛПС у больных атопической БА легкого течения концентрация ИЛ-10 составила 310,38 (195,18-353,8) пг/мл, среднего течения - 320,48 (300,9-491,3) пг/мл, а у здоровых доноров 78,03 (42,32-146,6) пг/мл. Таким образом, мы установили, что в группе больных атопической БА как легкого, так и среднего течения концентрация ИЛ-10 под действием ЛПС стати стически достоверно повысилась по сравнению со здоровыми донорами. У больных II группы не выявили достоверного увеличения индуцированной ЛПС выработки ИЛ-10 МНК. Действие ПГ приводило к увеличению продукции ИЛ-10 МНК периферической крови больных БА по сравнению с группой здоровых доноров, однако выявленные изменения не были статистически достоверными. Таким образом, у больных атопической и смешанной формами БА выявили TLR2 и TLR4-опо-средованное повышение продукции ФНОа, ИЛ-18 и ИЛ-10. Повышение TLR-опосредованной выработки цитокинов у больных БА свидетельствует об увеличении функциональной активности TLR2 и TLR4 и вовлечении этих рецепторов в иммунопатогенез бронхиальной астмы, что в дальнейшем может определять восприимчивость больных БА к инфекционным агентам. Изменение функциональной активности TLRs может объяснять предрасположенность больных БА к развитию осложнений, а TLRs - служить новой мишенью для терапевтического воздействия.